Caracterização do potencial bioativo do óleo essencial e do extrato aquoso das folhas de Croton blanchetianus Baill

Abstract

Considerando a busca por antimicrobianos provenientes de fontes naturais, o Croton blanchetianus (marmeleiro) se mostra como uma alternativa promissora, por ser uma planta presente no bioma Caatinga, que apresenta atividade biológica. Dessa forma, este trabalho objetivou caracterizar e avaliar o óleo essencial (OECB) e o extrato aquoso (EACB) das folhas frescas e secas de C. blanchetianus. Para tal, no OECB foram identificados os compostos químicos, a atividade antimicrobiana, o efeito toxicológico e a ação desse óleo essencial sobre bactérias patogênicas e as ácido-lácticas (BAL) deteriorantes, a qual foi modelada. No EACB foram avaliadas a atividade antioxidante e antimicrobiana de compostos bioativos. O OECB das folhas frescas e secas foi extraído por hidrodestilação e o EACB, proveniente do processo de obtenção do óleo essencial, foi coletado e liofilizado. No EACB foram quantificados os compostos fenólicos, taninos, flavonoides e atividade antioxidante por meio de métodos espectrofotométricos. Foi determinada a atividade antimicrobiana pelo método de microdiluição em caldo, e os danos morfológicos causados às células bacterianas foram observados por Microscopia Eletrônica de Transmissão. Foi realizada a caracterização físico-química do OECB, sendo determinada a densidade e o índice de refração. A análise da composição química dos OECBs foi feita por cromatografia gasosa acoplada à espectrofotometria de massa (CG-EM). A avaliação da atividade antimicrobiana do OECB proveniente das folhas frescas e secas foi realizada pelo método de difusão em ágar, sobre as bactérias patogênicas (BP) Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella Enteritidis e Escherichia coli, que são patógenos de interesse em alimentos. Foram ainda determinadas a concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) do OECB sobre as BP e as BAL, Weissella viridescens e Leuconostoc mesenteroides, pelo método da microdiluição. No óleo essencial das folhas secas, a toxicidade foi avaliada utilizando o microcrustáceo Artemia salina. Para avaliação da ação do OECB sobre as BAL, foram determinadas a dose inibitória mínima (DIM) na fase vapor e realizada a análise dos compostos voláteis do óleo essencial por CG-EM, pela técnica de headspace. A cinética microbiana foi estudada para as BP e BAL com concentrações de 0,90, 1,80, 2,71 e 4,51 mg/mL do óleo essencial das folhas secas. Para modelar a ação do óleo essencial sobre as BP e BAL comparou-se os modelos de inativação log-linear com ombro e Weibull, e de crescimento de Gompertz modificado e Baranyi e Roberts. Na análise estatística, foram utilizados os índices: coeficiente de determinação, raiz do erro médio quadrático, fator de tendência e fator de exatidão. Os resultados mostraram a presença de elevados teores de compostos fenólicos, taninos e flavonoides, bem como a presença de antioxidantes no extrato aquoso. O EACB das folhas frescas e secas apresentaram atividade contra S. aureus e L. monocytogenes, e provocaram danos celulares, mas não foram efetivos sobre S. Enteritidis e E. coli. Os compostos químicos majoritários presentes no OECB, de ambas as folhas, foram: a-pineno, eucaliptol, sativeno, E-cariofileno, biciclogermacreno e espatulenol. O eucalyptol e D-a-pinene são os voláteis majoritários presentes no óleo essencial das folhas secas. A densidade relativa e o índice de refração do óleo essencial das folhas secas foram 0,9025 g/mL e 1,4963, respectivamente. O óleo essencial das folhas frescas e secas apresentou atividade antimicrobiana variável contra as diferentes BP testadas, no entanto, o óleo essencial proveniente das folhas secas mostrou uma maior ação contra as BP. Observou-se o efeito bacteriostático e bactericida sobre as BAL, tanto na fase liquida como na fase de vapor do óleo essencial. A concentração letal (CL50) do OECB das folhas secas sobre a A. salina foi de 326 µg/mL, considerado moderadamente tóxico. Nas cinéticas, o OECB inativou as BAL, e o modelo primário de Weibull foi o que melhor descreveu a inativação ao longo do tempo para W. viridescens (com ? fixo de 1,52) e L. mesenteroides (com ? fixo de 1,49). As bactérias L. monocytogenes e S. aureus também foram inativadas pelo OECB, descritas pelo modelo de Weibull com ? fixos de 0,74 e 1,11, respectivamente. As bactérias S. Enteritidis e E. coli não foram inibidas pelo OECB e apresentaram cinéticas de crescimento que foram descritas pelo modelo de Baranyi e Roberts. Estes resultados demonstram a potencialidade de aplicação do extrato aquoso e do óleo essencial das folhas do C. blanchetianus como fontes alternativas de compostos antimicrobianos e compostos bioativos com ação antioxidante no extrato aquoso, destacando-se por serem produtos naturais.

Abstract: Considering the search for antimicrobials from natural sources, Croton blanchetianus (marmeleiro) shows itself as a promising alternative because it is a plant present in the Caatinga biome, which has biological activity. Thus, this work aimed to characterize and evaluate the essential oil (CBEO) and aqueous extract (CBAE) of fresh and dry leaves of C. blanchetianus. To this end, the CBEO identified the chemical compounds, the antimicrobial activity, the toxicological effect and the action of this essential oil on lactic acid and pathogenic bacteria, which was modeled. In the CBAE, the antioxidant and antimicrobial activity of bioactive compounds were evaluated. The CBEO from the fresh and dry leaves was extracted by hydrodistillation and the CBAE, from the essential oil process, was collected and lyophilized. In the CBAE, phenolic compounds, tannins, flavonoids and antioxidant activity were quantified through spectrophotometric methods, the antimicrobial activity was determined by the broth microdilution method, and the morphological damage caused to bacterial cells was observed by Transmission Electron Microscopy. The physical-chemical characterization of the CBEO was carried out, and the density and refractive index were determined. The analysis of the chemical composition of the CBEOs was performed by gas chromatography coupled to mass spectrophotometry (GC-MS). The evaluation of the antimicrobial activity of CBEO from fresh and dried leaves was performed by the agar diffusion method, on pathogenic bacteria (PB) Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella Enteritidis, Escherichia coli, which are pathogens of interest in food. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of CBEO on PB and lactic acid (LAB), Weissella viridescens and Leuconostoc mesenteroides were also determined by the microdilution method. In the essential oil of the dried leaves, the toxicity was evaluated using the microcrustacean Artemia salina. To evaluate the action of CBEO on LAB, the minimum inhibitory dose (MID) in the vapor phase was determined and the analysis of volatile compounds of the essential oil was performed by GC-MS, using the headspace technique. Microbial kinetics were studied for PB and LAB with concentrations of 0.90, 1.80, 2.71 and 4.51 mg/mL of essential oil from dried leaves. To model the action of the essential oil on the PB and LAB, the log-linear inactivation models with shoulder and Weibull, and the modified Gompertz and Baranyi and Roberts growth models were compared. In the statistical analysis, the coefficient of determination, root mean square error, trend factor and accuracy factor were used. The results showed the presence of high levels of phenolic compounds, tannins and flavonoids, as well as the presence of antioxidants in the aqueous extract. CBAE from fresh and dried leaves showed activity against S. aureus and L. monocytogenes, and caused cellular damage, but were not effective against S. Enteritidis and E. coli. The major chemical compounds present in the CBEO, from both leaves, were: a-pinene, eucalyptol, sativene, E-caryophyllene, bicyclogermacrene and spathulenol. Eucalyptol and D-a-pinene are the major volatiles present in the essential oil of dried leaves. The relative density and refractive index of the essential oil of the dried leaves were 0.9025 g/mL and 1.4963, respectively. The essential oil from the fresh and dry leaves showed variable antimicrobial activity against the different PB tested, however, the essential oil from the dry leaves showed a greater action against the PB. The bacteriostatic and bactericidal effect on LAB was observed, both in the liquid phase and in the vapor phase of the essential oil. The lethal concentration (LC50) of CBEO from dried leaves on A. salina is 326 µg/mL, which was considered moderately toxic. In the kinetics, the CBEO inactivated the LAB, and the Weibull primary model was the one that best described the inactivation over time for W. viridescens (with a fixed ? of 1.52) and L. mesenteroides (with a fixed ? of 1.49). 49). The bacteria L. monocytogenes and S. aureus were also inactivated by the CBEO, described by the Weibull model with fixed ? of 0.74 and 1.11, respectively. The bacteria S. Enteritidis and E. coli were not inhibited by the CBEO and showed growth kinetics that were described by the Baranyi and Roberts model. These results show the potential of application of the aqueous extract and essential oil of the leaves of C. blanchetianus as alternative sources of antimicrobial compounds and bioactive compounds with antioxidant action in the aqueous extract, standing out for being natural products.