Padronização de PCR em Tempo Real para Identificação de Neisseria gonorrhoeae

Abstract

Introdução: Neisseria gonorrhoeae, é o agente etiológico da gonorreia, infecção que acomete as mucosas do trato urogenital, reto, orofaringe, conjuntiva e em alguns casos, pode evoluir para doença inflamatória pélvica e sepse. Isolados resistentes a todas as classes de antimicrobianos utilizados no tratamento da infecção gonocócica são consideradas uma ameaça à saúde pública. Dessa forma, para conter o avanço da transmissão de isolados resistentes, é necessário que os países realizem projetos de monitoramento e vigilância das isolados circulantes, a fim de adequar os esquemas terapêuticos nacionais. O presente estudo teve como objetivo otimizar uma etapa importante do estudo de vigilância realizado pelo Laboratório de Biologia Molecular, Microbiologia e Sorologia, de forma a implantar de PCR em tempo real para a identificação Neisseria gonorrhoeae, substituindo a técnica que atualmente é executada no laboratório, tendo em vista que processos que minimizem o tempo de processamento, e aumentem a sensibilidade, são fundamentais para a melhoria da execução e aumento da capacidade de avaliação do projeto. O custo-benefício entre as duas técnicas também foi avaliado. Materiais e métodos: Treze pares de iniciadores foram avaliados in silícico pela especificidade e tamanho de produto amplificado, para posterior testagem in vitro utilizando cepas Neisseria gonorrhoeae presentes no laboratório. Foi selecionado e adaptado de Hjelmevoll e colaboradores (2006), um par de iniciadores para o alvo pseudogene porA. Em seguida foi realizada a padronização de PCR em tempo real utilizando o master mix PowerUp SYBR Green (Applied Biosystems, EUA). Resultados: Os iniciadores que geravam produto amplificado com tamanho inadequado para PCR em tempo real e com pouca especificidade foram descartados para utilização na padronização. O iniciador porA, sintetizado para a padronização da qPCR, foi testado na concentração de 0,4, 0,8, 1,2, e 1,6μL, sendo a concentração de 1,6μL escolhida para a padronização. A qPCR apresentou alta sensibilidade frente a todas os isolados de Neisseria gonorrhoeae, com eficiência de 94%, porém, são necessários mais testes frente a cepas de bactérias diferentes para verificar sua especificidade. Discussão: A PCR em tempo real é uma técnica que demanda menos trabalho que a PCR convencional, e além de apresentar maior sensibilidade, o processamento de múltiplas amostras é rápido, pois não depende de visualização em gel de agarose ao final. Além disso, o gene alvo é o ponto principal para a padronização do método, sendo necessário métodos que possibilitam averiguar sua especificidade. Na avaliação do custo-benefício, a PCR convencional além de necessitar de mais mão de obra na execução, apresentou um custo maior do que a PCR em tempo real no processamento de vinte amostras simultaneamente. Conclusão: A PCR em tempo real apresentou resultados satisfatórios na identificação dos isolados. Porém, pela qPCR ser uma técnica mais rápida e sensível na identificação de patógenos, a sua padronização demanda etapas essenciais e cruciais anterior a sua utilização, necessitando de um amplo painel de cepas de referência de bactérias, diferentes de Neisseria gonorrhoeae, para serem testadas antes da sua implementação na rotina laboratorial do projeto de vigilância realizado no LBMMS.