Otimização da ultracentrifugação diferencial para purificação de exossomos a partir de fluídos biológicos humanos.

Abstract

Exossomos são pequenas vesículas biológicas entre 30-150 nm, compostas por uma dupla membrana lipídica, produzidos por todos os tipo celulares, que carregam diferentes materiais citosólicos, e desempenham função na comunicação célula-célula. A literatura aponta que eles podem estar envolvidos com a modulação da resposta inflamatória, em diferentes doenças. Porém o isolamento exossomial é uma técnica com muitas variações na literatura, devido a diferentes condições de aparelhos e ambiente usado, e a sensibilidade da análise. Assim, o objetivo desse projeto é padronizar a técnica para isolamento de exossomos em plasma e urina de humanos. A padronização da técnica se deu com amostras biológicas de contribuintes saudáveis, diluindo estas em tampão fosfato salino, consistindo de 2 centrifugações e 2 ultracentrifugações para o isolamento de exossomos em relação a outras substâncias dos fluídos biológicos. O sucesso da técnica era comprovado com o aparelho Zetasizer, que analisou o tamanho das partículas. As técnicas com melhores resultados para plasma e urina foram obtidas ao coletar com PBS filtrado, e utilizar-se de uma primeira centrifugação de 2.000 g por 20 minutos e uma segunda centrifugação de 12.000 g 30 minutos, comum a plasma e urina. Então, ambos passarão por 2 ultracentrifugações, de 45.000 g por 60 minutos para as duas, e outra ultracentrifugação de 90.000 g por 90 minutos para plasma, e 100.000 g por 90 minutos para urina, comprovando-se a eficácia na análise do Zetasizer, com tamanhos de partículas compatíveis com os exossomiais reportados na literatura. Assim, pode-se dizer que a padronização foi alcançada com sucesso, uma vez que obtiveram-se vesículas com tamanho compatível, em diferentes amostras biológicas. Tal padronização abre oportunidades para estudo do papel dos exossomos em diferentes doenças inflamatórias como um potencial biomarcador para elas, o que pode representar um tratamento precoce e um melhor prognóstico para os pacientes.