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MicroRNAs são uma classe de pequenos RNAs não codificantes que estão envolvidos na regulação de diversos processos celulares, sendo bem caracterizados nas interações planta-patógeno, onde desempenham um papel importante na defesa da planta ou no estabelecimento do patógeno. O feijão (Phaseolus vulgaris) é uma importante fonte de proteína para a população latino-americana, principalmente a de baixa renda, e é acometido pela antracnose, doença que pode gerar perdas de até 100% na lavoura, causada pelo fungo Colletotrichum lindemuthianum. Considerando a importância desse patossistema, o objetivo do projeto de iniciação científica foi detectar novos miRNAs relacionados à doença em P. vulgaris. Para selecionar os miRNAs conhecidos envolvidos na resposta planta-patógeno, uma extensa pesquisa foi feita nas seguintes bases de dados: Web of Science, Scielo, Pubmed, Wiley, ScienceDirect e Google Acadêmico, usando as palavras-chave: “microRNA”, “pathogen”, e outras espécies de Fabaceae que não P. vulgaris. A pesquisa eliminou miRNAs de feijão que já haviam sido depositados no banco de dados de miRNAs PmiREN. Um total de 435 miRNAs foram encontrados na literatura, 66 dos quais já foram validados como miRNAs de P. vulgaris. As sequências restantes foram submetidas a um blastN para verificar sequências semelhantes no genoma do feijão. Um total de 22 miRNAs das espécies Cicer arietinum e Glycine max foram selecionados e pesquisados nos quatro genomas de feijão depositados no Phytozome. Sequências com alta similaridade (apenas um mismatch permitido) foram selecionadas para avaliação dos precursores de miRNAs. Assim, sequências com cerca de 200 nucleotídeos foram filtradas para testes de RNAfold pelo programa ViennaRNA Web Services. A análise de dobramento resultou em quatro miRNAs validados em feijão. Os novos miRNAs identificados nesta abordagem foram: miR028 localizado no cromossomo 02 do feijão, e do braço 5p da sequência pré-miRNA; mi1R56g localizado no cromossomo 02, proveniente do braço 5p do pré-miRNA; miR156i no cromossomo 02, do braço 5p do precursor; miR9560, localizado no cromossomo 06, e proveniente do braço 5p da sequência pré-miRNA; miR10405, que vem do cromossomo 05, no braço 3p de sua sequência precursora; É interessante que dois desses miRNAs, miR9560 e miR10405, sejam intrônicos, enquanto miR156g é intergênico, e miR028 vem de uma região codificadora. Essas descobertas demonstraram que uma abordagem in silico pode ser uma ferramenta muito poderosa para detectar novos miRNAs, bem como uma alternativa mais barata e prática ao sequenciamento high-throughput. Os novos miRNAs de P. vulgaris posteriormente serão validados experimentalmente usando RT-qPCR. |
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