Sensing electroporation during pulsed electric fields

Abstract

Os campos elétricos pulsados (PEF) podem melhorar ou ser uma alternativa a métodos tradicionais nas áreas de medicina e biotecnologia. Os PEF provocam abertura de poros na membrana celular (eletroporação). A eletroporação pode ser utilizada na transferência de substâncias para células, tratamento de cânceres ou pasteurização não térmica. A eletroporação é um fenômeno dinâmico caracterizado por alterar a permeabilidade da membrana. Esta tese tem como objetivo desenvolver um método de sensoriamento para eletroporação durante o protocolo PEF. Propomos usar a corrente do PEF para feedback. Essa abordagem não é invasiva e pode ser implementada usando os eletrodos existentes. Os métodos de detecção propostos podem ser usados para modelagem e controle da eletroporação. Foram executados quatro experimentos: (i) Investigação dos efeitos da amplitude de PEF para eletroporação irreversível em S. cerevisiae com medição da viabilidade celular, medidas de impedância macroscópica, microscopia eletrônica de varredura e simulações numéricas. A eletroporação irreversível com 500 kV/m reduz os números de levedura aos níveis industriais para vinho. Foi detectado um aumento de 15% nas medições de corrente do PEF para uma diminuição de 100 vezes na viabilidade para 105 células/ml. A microscopia eletrônica mostra detalhes de danos na levedura. A corrente contínua é afetada por outros efeitos além da eletroporação, pois o PEF contém um amplo espectro de frequências, principalmente sub-10 kHz (tipicamente sinais pulsados de alta tensão). (ii) Investigamos o uso de corrente alternada sobreposta ao protocolo PEF para mitigar outros efeitos de interferências. Com COMSOL foram realizadas simulações de eletroporação de leveduras e demonstrado que a membrana e parede celular são suscetíveis à passagem da corrente de deslocamento iniciando entre 10 kHz a 10 MHz. Meios biológicos possuem uma caracterização particular no espectro de frequências. Esses contribuem com a maior parte da dispersão macroscópica tipo ß, característica de interesse no desenvolvimento de sensores. A medição de impedância em certas frequências pode ser usada para detectar eletroporação. (iii) Foi desenvolvido um gerador de sinais capaz gerar PEF com sobreposição de sinais arbitrários. O sistema desenvolvido gera formas de onda de até ± 85 V, 12 A e 100 kHz (THD < 2,5% a ± 30 Vpp). Phantoms de gel (com condutividade semelhante aos tecidos biológicos, 0,1 S/m em dezenas de kHz) e propensos a acumular íons nos eletrodos foram usados para estudar os efeitos da polarização. Os resultados não mostraram mudanças significativas de impedância em 100 kHz devido à polarização do eletrodo. A leitura em 100 kHz reduz erros devido à polarização dos eletrodos, e o sistema é satisfatório para avaliar respostas em 100 kHz com polarização DC. (iv) Foi realizado o estudo in vitro com S. Tuberosum utilizando protocolos PEF com seno sobreposto de 100 kHz. A análise da impedância complexa em função do PEF ainda não foi discutida na literatura. Os resultados mostram que certos níveis de PEF induzem uma redução no efeito capacitivo da amostra em 100 kHz (deslocamento de dispersão ß), e a capacitância não é mais a principal característica da amostra em experimentos de eletroporação irreversível do tecido.

Abstract: Pulsed electric fields (PEF) can improve and be an alternative to traditional methods in the areas of medicine and biotechnology. PEF can open pores in the cell membrane; this phenomenon is called electroporation. Electroporation can be used to transfer substances to cells, treat cancers or non-thermal pasteurisation. Electroporation is a dynamic phenomenon characterized by altering the cell membrane permeability. This thesis aims to develop a sensing method for electroporation during the PEF protocol. We propose using the PEF current reading to get treatment feedback. This approach is non-invasive and can be implemented using the existing PEF electrodes. Ultimately the proposed methods can be used to better understand (e.g., modelling) and control electroporation. We executed four experiments to support the objective: (i) We investigated the effects of irreversible electroporation pulse amplitude on S. cerevisiae using cell viability tests, macroscopic impedance measurements, scanning electron microscopy and numerical simulations. Irreversible electroporation proved to reach active yeast limits established by wine standards within 500 kV/m. We detected a 15% increase in the pulse current measurements for a 100-fold yeast viability decrease to 105 cells/ml. Scanning electron microscopic show details of PEF-triggered yeast surface damage. The direct current is affected by other effects rather than electroporation as PEF contain a broad spectrum of frequencies, mainly sub-10 kHz (typically pulsed high voltage signals). (ii) We investigate the use of alternating current superposing the PEF protocol to mitigate other effects interferences. We used COMSOL simulations with yeast electroporation model to demonstrate that the cell membrane and wall are susceptible to the passage of the displacement current starting between 10 kHz to 10 MHz. The biological media have specific characterization in the broad frequency spectrum. Those contribute with most of macroscopic dispersion ß, which is used to development of biological sensors. We show that certain frequencies could be used to detect the occurrence of electroporation, i.e., dielectric dispersion modulated sensing. (iii) We developed a custom signal generator capable of creating the PEF protocol with overlapping arbitrary signals. The system generates waveforms up to ± 85 V, 12 A and 100 kHz (THD < 2.5% at ± 30 Vpp). We used gel phantoms (with conductivity similar to the biological tissues, 0.1 S/m in tens of kHz) and likely to accumulate ions in the electrodes interface to study polarization effects. The results showed no significant changes at 100 kHz due to electrode polarization. It can be concluded that the reading at 100 kHz mitigates errors due to the electrodes polarization, and the system is satisfactory for evaluating responses at 100 kHz with DC bias. (iv) We executed in vitro study on S. Tuberosum using PEF and 100 kHz superposed sine. The analysis of the complex impedance as a function of the PEF has not yet been discussed in the literature. Our results show that certain levels of PEF induce a reduction in the sample's capacitive effect at 100 kHz (ß dispersion shift), and the capacitance is no longer the main characteristic of the sample at tissue's irreversible electroporation experiments.