Inibição de neuraminidases do hospedeiro como uma abordagem terapêutica para regular a resposta de neutrófilos na sepse e COVID-19

Abstract

Os ácidos siálicos de membrana, dentre outras funções, parecem regular as respostas imunes, já que sua remoção por neuraminidases (NEU) derivadas de patógenos induz as funções antimicrobianas de neutrófilos, como a fagocitose e a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs). No entanto, a contribuição da atividade de NEU derivada do hospedeiro na desregulação dessas células ainda não foi explorada. Dessa forma, esse estudo teve como objetivo investigar se a NEU do hospedeiro pode ser um alvo importante para regular a resposta de neutrófilos em contextos inflamatórios mimetizados in vitro pela estimulação com o lipopolissacarídeo (LPS), ex vivo a partir de neutrófilos isolados de pacientes com COVID-19, e in vivo em modelos animais de sepse e de inflamação pulmonar aguda semelhante a COVID-19. Foi demonstrado nesse estudo que o desafio de neutrófilos com o LPS induz o aumento da atividade de NEU e a clivagem de ácidos siálicos nas conformações a2,3 e a2,6. Esses eventos foram acompanhados de alterações fenotípicas características de ativação celular avaliados pela manutenção da expressão dos marcadores dos superfície CD66b, CD62L, CXCR2 e CD11b e do aumento das funções de neutrófilos. Esses efeitos foram reduzidos na presença dos inibidores da NEU viral Oseltamivir e Zanamivir. Ainda foi observado que na presença do LPS ocorre um aumento do subtipo NEU1 na membrana celular onde a interação com a matriz metaloproteinase (MMP)-9 é um fator determinante para que os efeitos do LPS ocorram. Também foi demonstrado que animais submetidos aos modelos de sepse induzida por peritonite ou pneumonia e tratados com Oseltamivir apresentaram uma diminuição da infiltração difusa de neutrófilos para os pulmões com regulação da migração celular para o foco da infecção. Esses resultados foram acompanhados por uma melhora do perfil bactericida, diminuição da inflamação local e sistêmica, redução dos marcadores de injúria tecidual e manutenção dos níveis de ácidos siálicos na superfície de neutrófilos circulantes. Isso resultou em altas taxas de sobrevida dos animais tratados. A partir de uma reanálise de sequenciamento de RNA single cell de amostras do trato respiratório inferior e superior de pacientes com COVID-19 grave foi observado um aumento da percentagem de expressão de NEU1 em neutrófilos. Além disso, foi observado nesses indivíduos um aumento de NEU1 na membrana plasmática de neutrófilos e da atividade sialidase (plasmática e celular) com redução do conteúdo de ácidos siálicos na conformação a2,3. Por outro lado, a incubação ex vivo de neutrófilos com os inibidores de NEU foi capaz de modificar o estado de ativação celular e a perda de ácidos siálicos de membrana. Já o tratamento com o Oseltamivir em animais submetidos a infecção do trato respiratório com um betacoronavírus de murinos regulou a infiltração de neutrófilos para os pulmões e diminuiu ambos os danos pulmonares e a carga viral. Assim, a indução da atividade de NEU1 constitui um mecanismo que favorece a ativação exacerbada de neutrófilos avaliadas in vitro ou em condições de inflamação sistêmica. Essa enzima, por sua vez, pode ser considerada como um alvo do hospedeiro para regular a função de neutrófilos durante infecções graves.

Abstract: Membrane sialic acids, among other functions, seem to regulate immune responses, as their removal by pathogen-derived neuraminidases (NEU) induces neutrophils antimicrobial functions, such as phagocytosis and the production of reactive oxygen species (ROS). However, the contribution of host-derived NEU activity in neutrophils dysregulation has not yet been explored. Thus, this study aimed to investigate whether host NEU may be an important target to regulate the response of neutrophils in inflammatory contexts mimicked in vitro by stimulation with lipopolysaccharide (LPS), ex vivo from neutrophils isolated from COVID-19 patients, and in vivo in animal models of sepsis and COVID-19-like acute lung inflammation. It was demonstrated in this study that neutrophils challenge with LPS induces an increase in NEU activity and cleavage of sialic acids in the a2,3 and a2,6 conformations. These events were accompanied by phenotypic changes characteristic of cell activation assessed by the maintenance of expression of the surface markers CD66b, CD62L, CXCR2 and CD11b and the increase in neutrophil functions. These effects were reduced in the presence of the viral NEU inhibitors Oseltamivir and Zanamivir. It was also observed that in the presence of LPS there is an increase in the NEU1 subtype in the cell membrane where the interaction with the matrix metalloproteinase (MMP)-9 is a determining factor for the effect of LPS. It was also demonstrated that animals submitted to models of sepsis induced by peritonitis or pneumonia and treated with Oseltamivir showed a decrease in diffuse neutrophil infiltration into the lungs and regulation of cell migration to the focus of infection. These results were accompanied by an improvement in the bactericidal profile, a decrease in local and systemic inflammation, a reduction in tissue injury markers and maintenance of sialic acid levels on the surface of circulating neutrophils. This resulted in high survival rates for treated animals. From a single cell RNA sequencing reanalysis of lower and upper respiratory tract samples from patients with severe COVID-19, an increase in the percentage of NEU1 expression in neutrophils was observed. In addition, an increase in NEU1 in the plasma membrane of neutrophils and in sialidase activity (plasmatic and cellular) was observed in these individuals, with a reduction in the content of sialic acids in the a2,3 conformation. On the other hand, ex vivo incubation of neutrophils with NEU inhibitors was able to modify the cell activation state and the loss of membrane sialic acids. Oseltamivir treatment in animals subjected to respiratory tract infection with a murine betacoronavirus regulated the infiltration of neutrophils into the lungs and decreased both lung damage and viral load. Thus, the induction of NEU1 activity constitutes a mechanism that favors the exacerbated activation of neutrophils evaluated in vitro or under conditions of systemic inflammation. This enzyme, in turn, may be considered as a host target to regulate neutrophil function during severe infections.