Avaliação e modelagem do comportamento de sorotipos de Salmonella enterica sob estresse osmótico: um estudo do Fenômeno Fênix

Abstract

As bactérias do gênero Salmonella spp. estão entre os principais patógenos relacionados a surtos de origem alimentar, causando problemas de saúde pública e impactos econômicos negativos em todo o mundo. Salmonella enterica destaca-se pela capacidade de se adaptar a vários ambientes adversos, tal como alimentos com aw reduzida, próxima ao limite de crescimento dessa bactéria, considerados ambientes osmóticos estressantes. A exposição de S. enterica a esses ambientes pode levar ao comportamento caracterizado pela diminuição da concentração celular inicial, seguido de crescimento exponencial até atingir a fase estacionária, denominado Fenômeno Fênix (FF). O objetivo geral deste trabalho é avaliar e modelar a cinética do crescimento, sobrevivência e inativação de populações de S. enterica expostas ao estresse osmótico (aw de 0,940, 0,945, 0,950 e 0,960), próximo ao limite cresce/não cresce, que podem levar ao FF, considerando a influência do sorotipo (Typhimurium, Enteritidis, Heidelberg e Minnesota) e do estado fisiológico do inóculo (fase exponencial ou estacionária cultivado a 25 ou 35 °C). Nessa avaliação, será estudada ainda a heterogeneidade fisiológica e viabilidade celular da população de S. Typhimurium, ao longo da exposição a um ambiente osmótico estressante, que leva ao FF, por meio da técnica de citometria de fluxo (CF) acoplada aos marcadores fluorescentes laranja de tiazol (thiazole orange [TO]) e iodeto de propídio (propidium iodide [PI]). Será também avaliado e modelado o efeito da adaptação osmótica, durante o FF, sobre a resistência de sorotipos de S. enterica (Typhimurium, Enteritidis, Heidelberg e Minnesota) à irradiação UV-C (6,5 W/m2). Os resultados mostraram que, em aw de 0,950 e 0,960, todas os sorotipos apresentaram o comportamento característico do FF. A inoculação em meio com aw de 0,940 e 0,945 levou à inativação de todos os sorotipos estudados. As células provenientes de inóculo a partir da fase exponencial a 25 °C apresentaram maior redução populacional inicial e menor tempo para recuperação do crescimento até atingir a fase estacionária. O modelo matemático, proposto para descrever o comportamento microbiano durante o FF, considerou que a curva resultante era a soma de duas subpopulações (inativando e sobrevivendo/crescendo) e apresentou bons ajustes para todas as condições testadas. A análise de CF com dupla marcação fluorescente forneceu fortes evidências da ocorrência de três subpopulações simultâneas que levam ao FF, definidas como células intactas/viáveis, estressadas/injuriadas e danificadas. A resposta da CF mostrou alterações nos percentuais das subpopulações ao longo do tempo de exposição ao ambiente de estresse osmótico. Os resultados sugerem que a exposição prévia das células bacterianas a ambientes osmóticos que desencadeiam o FF leva ao aumento da resistência à aplicação subsequente do tratamento com UV-C. O modelo de inativação log-linear com ombro apresentou melhor ajuste que o modelo de Weibull para descrever as respostas de inativação celular sob luz UV-C. Células de S. Typhimurium, S. Heidelberg e S. Minnesota estressadas osmoticamente durante o FF foram mais resistentes à irradiação UV-C. Esse fato não foi observado para S. Enteritidis. Os resultados obtidos neste estudo mostram repostas complexas de S. enterica à exposição a ambientes osmóticos estressantes. Dessa maneira, o presente estudo contribui para garantia da qualidade e segurança dos alimentos, além de levar à melhoria de análises de riscos no processamento de alimentos.

Abstract: Bacteria of the genus Salmonella spp. are among the main pathogens related to foodborne outbreaks, causing public health issues and negative economic impacts worldwide. Salmonella enterica stands out for its ability to adapt to several adverse environments, such as foods with reduced aw, close to the growth limit of this bacteria, considered as osmotic stressful environments. The exposure of S. enterica to these environments can lead to a behavior characterized by a decrease in the initial cell concentration, followed by exponential growth until reaching the stationary phase, called the Phoenix Phenomenon (PP). The general objective of this work is to evaluate and model the kinetics of growth, survival and inactivation of populations of S. enterica exposed to osmotic stress (aw of 0.940, 0.945, 0.950 and 0.960), close to the grow/no grow limit, which can lead to the PP, considering the influence of the serotype (Typhimurium, Enteritidis, Heidelberg and Minnesota) and the physiological state of the inoculum (exponential or stationary phase cultivated at 25 or 35 °C). In this evaluation, the physiological heterogeneity and cellular viability of the population of S. Typhimurium will also be studied during exposure to a stressful osmotic environment, which leads to the PP, through the flow cytometry (FC) technique coupled with fluorescent stained of thiazole orange (TO) and propidium iodide (PI). The effect of osmotic adaptation, during PP, on the resistance of S. enterica serotypes (Typhimurium, Enteritidis, Heidelberg and Minnesota) to UV-C irradiation (6,5 W/m2) will also be evaluated and modeled. The results showed that, in aw de 0.950 and 0.960, all serotypes showed the characteristic behavior of PP. The inoculation in medium with aw= 0.940 and 0.945 led to inactivation for all serotypes studied. Cells from inoculum from the exponential phase at 25 °C showed greater initial population reduction and less time for growth recovery until reaching the stationary phase. The mathematical model, proposed to describe the microbial behavior during the PP, considered that the resulting curve was the sum of two subpopulations (inactivating and surviving/growing) and presented good fits for all tested conditions. The analysis of FC with double fluorescent labeling provided strong evidence of the occurrence of three simultaneous subpopulations that lead to the PP, defined as intact/viable, stressed/injured, and damaged cells. The FC response showed changes in the percentages of subpopulations over time of exposure to the osmotic stress environment. The results suggest that prior exposure of bacterial cells to osmotic environments that trigger the PP leads to increased resistance to the subsequent application of UV-C treatment. The log-linear with shoulder inactivation model showed a better fit than the Weibull model to describe cell inactivation responses under UV-C light. S. Typhimurium, S. Heidelberg and S. Minnesota cells osmotically stressed during PP were more resistant to UV-C irradiation. This fact was not observed for S. Enteritidis. The results obtained in this study show complex responses of S. enterica to exposure to stressful osmotic environments. In this way, the present study contributes to ensuring the quality and safety of food, in addition to improving risk analysis in food processing.