Bacterial nanocellulose biocomposites and hydroxyapatite with cationic substitution by Mg²+, Cu²+, Zn²+ and Sr²+ for bone regeneration

Abstract

O uso de biocompóstitos para regeneração óssea guiada (GBR) tem despertado grande interesse pelas possibilidades de sinergia de propriedades. A nanocelulose bacteriana (BNC) é um biopolímero promissor por sua alta cristalinidade, capacidade de retenção de água, nanoestrutura porosa interconectada tridimensional e biocompatibilidade. Enquanto, a hidroxiapatita (HAp) é o principal constituinte dos componentes inorgânicos do tecido ósseo, possui excelente biocompatibilidade, bioatividade e osteocondutividade. Além disso, a incorporação de alguns elementos como Mg2+ ou Sr2+ na forma de oligoelementos pode desempenhar um importante papel no crescimento e reparo ósseo. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito da substituição catiônica em biocompósitos de BNC com HAp e apatitas de Mg2+, Cu2+, Sr2+ e Zn2+, para aplicação em regeneração óssea guiada. Para tanto, foram produzidas membranas de BNC utilizando a bactéria Komagataeibacter hansenii, estas após a purificação foram funcionalizadas por ciclos de imersão com hidroxiapatita (BNC/HAp) e híbridos de cobre (BNC/CuHAp), magnésio (BNC/MgHAp), zinco (BNC/ZnHAp) e estrôncio (BNC/SrHAp) e biotativadas em fluido corporal simulado (SFB). As amostras obtidas foram liofilizadas e caracterizadas por espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier com refletância total atenuada (FTIR/ATR), análise termogravimétrica (TGA), microscopia eletrônica de varredura com espectroscopia por energia dispersiva (SEM/EDS), difração de raios X (DRX) e Raman. Foram determinados o grau de intumescimento, porosidade, propriedades antimicrobianas, citotoxicidade adesão e proliferação de osteoblastos e ensaio de degradação enzimática in vitro. Os primeiros resultados para os biocompósitos BNC/MgHAp e BNC/CuHAp demonstraram que as formulações mantiveram boa porosidade. Os espectros de FTIR apresentaram as bandas características da BNC e bandas relacionadas ao grupamento HPO42- , a análise de TGA demonstrou a presença de cerca de 50 a 72% em massa da fase mineral, demonstrando a formação dos biocompósitos para todas as formulações testadas. Quanto às análises de MEV, constatou-se a deposição de material inorgânico sobre as nanofibrilas da BNC, o EDS apontou a presença dos íons metálicos nos compósitos. A incorporação com Cu2+ proporcionou propriedades antimicrobianas aos biocompósito, mas exerceu atividade citotóxica, por outro lado, os biomateriais incorporados com Mg não apresentaram atividade antimicrobiana, mas também não exerceram citotoxicidade. Novas formulações foram testadas e um estudo com incorporação de Zn2+ e Sr2+ também foi proposto. Quanto às propriedades, os biocompósitos novos apresentaram características estruturais semelhantes aos anteriores. As análises de DRX e Raman apresentaram variações muito sutis, provavelmente, devido à baixa concentração utilizada. O resultado de citotoxicidade apontou como melhores as composições BNC/MgHAp, BNC/ZnHAp e BNC/SrHAp. O ensaio de adesão celular demonstrou que o crescimento dos osteoblastos foi siginificativamente maior em todos os tempos analisados para os biocompósitos em relação ao controle BNC/HAp. E, o ensaio de biodegradação enzimática, in vitro, demonstrou que as celulases foram capazes de atuar em pH 8,5 selecionado neste trabalho como indicador do processo de regeneração óssea, mostrando um potencial campo de estudo para a produção destes biocompósitos inteiramente bioabsorvíveis.

Abstract: The use of biocomposites for guided bone regeneration (GBR) has attracted great interest due to the possibilities of synergistic properties. Bacterial nanocellulose (BNC) is a promising biopolymer due to its high crystallinity, water holding capacity, three-dimensional interconnected porous nanostructure and biocompatibility. While hydroxyapatite (HAp) is the main constituent of the inorganic components of bone tissue, it has excellent biocompatibility, bioactivity and osteoconductivity. Furthermore, incorporating elements such as Mg2+ or Sr2+ in trace elements can play an essential role in bone growth and repair. This work aimed to study the effect of cationic replacement in BNC biocomposites with HAp and Mg2+, Cu2+, Sr2+ and Zn2+ apatites for application in guided bone regeneration. For this purpose, BNC membranes were produced using the bacterium Komagataeibacter hansenii. After purification, they were functionalized by immersion cycles with hydroxyapatite (BNC/HAp) and copper hybrids (BNC/CuHAp), magnesium (BNC/MgHAp), zinc (BNC/ZnHAp) and strontium (BNC/SrHAp) and bioactivated in simulated body fluid (SFB). The samples obtained were freeze-dried and characterized by Fourier transform infrared spectroscopy with attenuated total reflectance (FTIR/ATR), thermogravimetric analysis (TGA), scanning electron microscopy with energy dispersive spectroscopy (SEM/EDS), X-ray diffraction (XRD) and Raman. The degree of swelling, porosity, antimicrobial properties, cytotoxicity, adhesion and proliferation of osteoblasts and in vitro enzymatic degradation assay were determined. The first results for the BNC/MgHAp and BNC/CuHAp biocomposites showed that the formulations maintained good porosity. The FTIR spectra showed the characteristic bands of BNC and bands related to the HPO42- group. The TGA analysis showed about 50 to 72% by mass of the mineral phase, demonstrating the formation of biocomposites for all formulations tested. As for the SEM analysis, it was found that the deposition of inorganic material on the nanofibrils of the BNC and the EDS indicated the presence of metallic ions in the composites. The incorporation with Cu2+ provided antimicrobial properties to the biocomposite but exerted cytotoxic activity. On the other hand, the biomaterials incorporated with Mg2+ did not show antimicrobial activity and did not exert cytotoxicity. New formulations were tested, and a study incorporating Zn2+ and Sr2+ was also proposed. As for the properties, the new biocomposites presented structural characteristics similar to the previous ones. XRD and Raman analyses showed subtle variations, probably due to the low concentration. The cytotoxicity result showed the best compositions of BNC/MgHAp, BNC/ZnHAp and BNC/SrHAp, and from this point on, the assays with Cu2+ were not continued. The cell adhesion assay showed that osteoblast growth was significantly higher at all times analyzed for the biocomposites concerning the BNC/HAp control. Furthermore, the enzymatic biodegradation assay, in vitro, showed that the cellulases could act at pH 8.5 selected in this work as an indicator of the bone regeneration process, demonstrating a potential field of study for the production of these fully bioabsorbable biocomposites.