Validação de um gene alvo do hsa-miR-183-5p na linhagem de câncer de próstata PC-3: inibição do miRNA como potencial estratégia terapêutica no câncer de próstata metastático

Abstract

Os microRNAs (miRNAs) consistem em uma classe de pequenas moléculas de RNA que são responsáveis por regular a expressão gênica a partir da complementariedade de bases com o RNA mensageiro (mRNA), inibindo ou induzindo a tradução de proteínas. A expressão aberrante dos miRNAs tem sido associada com o desenvolvimento e evolução de doenças, incluindo neoplasias, podendo atuar como oncogene ou supressor tumoral. Desta forma, identificar os alvos moleculares de miRNAs tem atraído o interesse científico para a compreensão do papel e a importância destes ácidos nucleicos no desenvolvimento e progressão do câncer, assim como o respectivo potencial como alvo terapêutico. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi investigar e validar um gene alvo do miR-183-5p, cuja expressão encontra-se alterada em linhagem de câncer de próstata. Inicialmente, o perfil de expressão de miRNAs nas linhagens de câncer de próstata PC-3 e LNCaP e na linhagem não tumoral da próstata RWPE-1 foram determinados por microarranjo. A partir dos valores de p e fold change, o miR-183-5p foi escolhido e a sua expressão diferencial nas diferentes linhagens foi confirmada por qPCR. Para identificar potenciais alvos moleculares do miR-183-5p foram utilizadas três ferramentas de bioinformática: LinkedOmics, miRWalk 2.0 e Gene Ontology Resouce. Entre os potenciais alvos identificados, TIMP3 foi o gene selecionado para a validação experimental. Para isto, as células da linhagem PC-3 foram transfectadas com o inibidor e o mimético do miR-183-5p e a expressão de TIMP3 foi analisada por qPCR e Western blot. Foi observado que ao inibir a expressão do miR-183-5p nas células PC-3, obteve-se um aumento significativo na expressão de TIMP3. Além disso, foi identificado que ao inibir o miR-183-5p nas células PC-3 houve uma diminuição na capacidade de invasão celular. Adicionalmente, foi utilizada a base de dados STRING para identificar os genes modulados por TIMP3 e que desempenham papel importante para a invasão celular, sendo identificados os seguintes genes: MMP2, MMP3, MMP9 e ADAM17. Desta forma, foi observado que ao inibir a expressão do miR-183-5p nas células PC-3, houve uma redução significativa na expressão de MMP3 e MMP9. Portanto, o presente estudo demonstrou que TIMP3 é um alvo molecular do miR-183-5p nas células de câncer de próstata PC-3, assim como demonstra regular a expressão gênica das metaloproteinases MMP-3 e MMP-9. Assim, demonstrando o potencial do miR-183-5p como alvo terapêutico para terapia molecular do câncer de próstata.

Abstract: MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs responsible for regulating gene expression through the complementarity of bases with messenger RNA (mRNA), inhibiting or inducing protein translation. Aberrant expression of miRNAs has been associated with the development and evolution of diseases, including neoplasms, which may act as oncogenes or tumor suppressors. Thus, identifying miRNAs molecular targets has attracted scientific interest to understand their role and importance in cancer development and progression, as well as their potential as therapeutic targets. In view of these premises, the aim of this work was to identify and validate a molecular target of miR-183-5p, which is differentially expressed in prostate cancer cells. Initially, the miRNA expression profile in the prostate cancer cell lines PC-3 and LNCaP and in the non-tumoral prostate cell line RWPE-1 were determined by microarray. From the p and fold change values, miR-183-5p was chosen and the differential expression by the cell lineages was confirmed by qPCR. To identify a potential miR-183-5p gene target, three bioinformatics tools were used: LinkedOmics, miRWalk v. 2.0, and Gene Ontology Resource. Among all potential targets identified, TIMP3 was the gene selected for experimental validation. For this, PC-3 cells were transfected with an inhibitor and a mimic of miR-183-5p and the expression of TIMP3 was analyzed by qPCR and Western blotting. As result, it was demonstrated that the miR-183-5p downregulation in PC-3 cells significantly enhanced TIMP3 expression. Furthermore, it was identified that by inhibiting miR-183-5p expression in PC-3 cells there was a reduction in the cell invasion competence. Additionally, the STRING database was used to identify the genes modulated by TIMP3 and that play an important role in cell invasion. The following genes were identified: MMP2, MMP3, MMP9 and ADAM17. Thus, inhibit the miR-183-5p expression in PC-3 cells significantly reduces the MMP3 and MMP9 expression. Therefore, the present study demonstrated that TIMP3 is a target gene of miR-183-5p in prostate cancer cells PC-3, as well as regulates the MMP-3 and MMP-9 gene expression. Thus, demonstrating the potential of miR-183-5p to be a therapeutic target for molecular therapy to prostate cancer.