Análise proteômica de L. interrogans sv. Copenhageni str. 10A em resposta a disponibilidade de zinco

Abstract

Leptospiras são bactérias Gram-negativas móveis dotadas de estratégias para invasão e disseminação eficientes no hospedeiro. Sendo classificada como o agente etiológico da leptospirose, uma doença infecciosa emergente com complicações humana e veterinária. Esta doença é transmitida ao homem através da urina de animais infectados, principalmente roedores, ou com ambiente contaminado pela urina destes animais. Mesmo sendo considerada a maior zoonose em termos de morbidade e mortalidade, a leptospirose ainda é uma doença negligenciada. A relação patógeno-hospedeiro dessa zoonose está sendo progressivamente descrita. Sabe-se que o hospedeiro emprega uma série de estratégias para privar o patógeno de metais essenciais, como o zinco, ou também conter as infecções bacterianas aumentando o nível de metais. Esse processo é denominado imunidade nutricional. O zinco é considerado um dos nutrientes metálicos fundamentais na modulação das interações patógeno-hospedeiro, sendo um componente estrutural, catalítico e regulatório de diversas biomoléculas. Sendo assim, descrever o processo no qual as leptospiras controlam a disponibilidade intracelular do cofator metálico zinco é essencial para compreender os mecanismos realizados por essa bactéria para sobreviver tanto a privação de zinco quanto a toxicidade. Nesse trabalho, investigamos o perfil proteômicos de Leptospira interrogans sv. Copenhageni str. 10A cultivada em meio Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris contendo o quelante de zinco TPA ou ZnCl2. As concentrações de metal e quelante foram pré-determinadas por uma curva de viabilidade por microscopia de campo escuro fazendo uso de uma câmara de contagem Petroff-Hausser realizada com diferentes concentrações das moléculas. Um total de 2161 proteínas foram identificadas no proteoma celular de L. interrogans. Após a triagem de proteínas identificadas em todas as réplicas biológicas, analisamos 513 proteínas, onde exclusivamente 195 proteínas foram reprimidas por zinco e 318 induzidas. Além disso, 163 pertencentes exclusivas da condição limitada de zinco e 141 proteínas únicas de zinco. As proteínas identificadas como diferencialmente expressas entre as condições experimentais (razão de abundância entre TPA/ZINCO =1,5 e =0,75)foram catalogadas conforme clusters de grupos ortólogos (COGs), sendo eles: (i) funções metabólicas 37,8% das proteínas identificadas; (ii) armazenamento e processamento de informações 21,08%; (iii) processos celulares e sinalização 28,04%; e (iv) mal caracterizados 10,65%. Todos os processos analisados apresentam proteínas reprimidas e induzidas por zinco, mostrando como o proteoma de L. interrogans é dinâmico e reforça o papel essencial do zinco em diversas vias e processos celulares. Nossos dados revelaram uma dinâmica no proteoma da bactéria, impactando em diversos processos celulares. A grande maioria das proteínas expressas diferencialmente entre as condições estão envolvidas com funções metabólicas. Dentre elas, o metabolismo de compostos de 1 carbono, a via de biossíntese do folato e a biossíntese de aminoácidos e nucleotídeos. Além disso, processos importantes para a interação leptospira/hospedeiro como motilidade e quimiotaxia se apresentam induzidos pelas alterações da disponibilidade de zinco. Proteínas estocadoras de zinco (ribossomais), chaperonas moleculares e proteínas pertencentes a sistemas do tipo ABC foram induzidas por zinco em L. interrogans. Este trabalho identificou várias proteínas classificadas como hipotéticas no proteoma da bactéria. A sua maioria, não apresenta similaridade com proteínas já descritas, reforçando a importância de maiores estudos para a compreensão de seu papel na tolerância ao zinco. Estudos envolvendo a homeostase do zinco em L. interrogans são necessários para interpretar como as leptospiras sentem e respondem aos diversos microambientes. Além disso, tais fatores impulsionam a necessidade de definir mecanismos de virulência, estratégias de adaptação ambiental e descobrir novas opções terapêuticas.

Abstract: Leptospires are motile Gram-negative bacteria with strategies for efficient invasion and dissemination in the host. They are classified as the etiological agent of Leptospirosis, an emerging infectious disease with human and veterinary complications. This disease is transmitted to humans through the urine of infected animals, mainly rodents, or through environments contaminated by the urine of these animals. Even though it is considered the major zoonosis in terms of morbidity and mortality, leptospirosis is still an extremely neglected disease. The pathogen-host relationship of this zoonosis is being progressively described. It is known that the host employs several strategies to deprive the pathogen of essential metals, such as zinc, and contain bacterial infections by increasing the level of metals. This process is called nutritional immunity. Zinc is considered one of the key metal nutrients in modulating pathogen-host interactions, being a structural, catalytic, and regulatory component of several biomolecules. Therefore, describing the process by which leptospires controls the intracellular availability of the metal cofactor zinc is essential to understanding the mechanisms by which these bacteria survive zinc deprivation and toxicity. In this work, we investigated the proteomic profile of Leptospira interrogans sv. Copenhageni str. 10A grown in Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris medium containing the zinc chelator TPA or ZnCl2. The metal and chelator concentrations were predetermined by a viability curve with dark-field microscopy using a Petroff-Hausser counting chamber performed with different concentrations of the molecules. A total of 2161 proteins were identified in the cellular proteome of L. interrogans. After the screening of identified proteins in all biological replicates, we analyzed 513 proteins, where exclusively 195 proteins were repressed by zinc and 318 induced. In addition, 163 were exclusive to the zinc-limited condition and 141 proteins were unique to zinc. The proteins identified as being differentially expressed between the experimental conditions (abundance ratio between TPA/ZINC =1,5 e =0,75) were cataloged according to clusters of orthologous groups (COGs), these being: (i) metabolic functions 37.8% of the identified proteins; (ii) information storage and processing 21.08%; (iii) cellular processes and signaling 28.04%; and (iv) poorly characterized 10.65%. All the processes analyzed presented both repressed and zinc-induced proteins, showing how dynamic the proteome of L. interrogans is and also reinforcing the essential role of zinc in various cellular pathways and processes. Our data revealed a dynamic in the bacterial proteome, impacting several cellular processes. Most of the differentially expressed proteins between conditions are involved in metabolic functions. These include the metabolism of 1-carbon compounds, the folate biosynthesis pathway, and the biosynthesis of amino acids and nucleotides. Furthermore, important processes for leptospira/host interaction such as motility and chemotaxis are induced by changes in zinc availability. Zinc storage (ribosomal) proteins, molecular chaperones, and proteins belonging to ABC Transporter Systems were induced by zinc in L. interrogans. This work identified several proteins classified as hypothetical in the bacterial proteome. Most of them are not similar to previously described proteins, reinforcing the importance of further studies to understand their role in zinc tolerance. Studies involving zinc homeostasis in L. interrogans are necessary to interpret how leptospires sense and respond to various microenvironments. Furthermore, such factors drive the need to define virulence mechanisms, environmental adaptation strategies, and discover new therapeutic options.