Prospecção da atividade enzimática e biológica do secretoma e de metabólitos secundários do fungo Neofusicoccum parvum isolado da planta Avicennia schaueriana do Mangue do Itacorubi ? Ilha de Santa Catarina

Abstract

A grande demanda por novos ativos biológicos tem estimulado a bioprospecção de novos compostos a partir de diferentes fontes naturais, como os fungos endofíticos que apresentam diversidade genética e metabólica em função de sua coevolução com plantas e ecossistema em geral. O presente estudo buscou isolar e caracterizar fungos endofíticos do manguezal de Florianópolis, região do Itacorubi, selecionando amostras vegetais de três espécies de plantas Avicennia schaueriana, Laguncularia racemosa e Rhizophora mangle. O isolamento de fungos foi feito da raíz, caule e folha das plantas. Dentre as culturas axênicas, a cultura do fungo Neofusicoccum parvum foi selecionado pelo seu crescimento micelar acelerado para ser realizada a fermentação em estado sólido usando o arroz orgânico como substrato durante 7, 14 e 21 dias, visando explorar enzimas e metabólitos secundários ali produzidos. Os fermentados foram macerados quimicamente com diclorometano e metanol, e produzido então o extrato bruto. A caracterização química em sistema de Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência acoplado à Espectrometria de Massas (Ultra Performance Liquid Chromatography ? Mass Spectrometry - UPLC-MS) permitiu a identificação dos compostos 2,2'-Dimetil-3,3'-bi-1,4-naftoquinona, pertencente aos grupos das quinonas, Radicamina A, Anselone B, Calanone, Sespendole e Pestalotiopinona B. A partir do substrato fermentado após 21 dias realizou-se a análise da presença das enzimas amilase, celulase, peroxidase, lacase e lipase utilizando-se tampão de fosfato de sódio (Na3PO4) na concentração de 100 mM ajustado em pH 6 para extração do secretoma total de enzimas. Os principais compostos identificados pela caracterização química foram relatados com atividades biológicas variadas, como cardioprotetoras, anti-isquêmicas, anti-inflamatória, analgésico, atividade bacteriostática, bactericida em bactérias Gram negativas e Gram positivas, inibição de formação de biofilme e atividade antiviral. O resultado da avaliação da presença de atividade enzimática apresentou-se promissor para produção de amilase e peroxidase, não apresentando lacase e lipase nestas condições de extração. Já o extrato obtido utilizando-se solventes orgânicos foi submetido à ensaios de citotoxicidade nas linhagens VERO (ATCC CCL-81? - fibroblasto de rim de macaco verde da África), A549 (ATCC CCL-185? - câncer de pulmão humano) e L929 (ATCC CCL-1 ? - fibroblasto de rato). Não houve citotoxicidade significativa ou diferencial entre as linhagens testadas em até 500 µg/mL. Os ensaios de atividade virucida e antiviral realizados com modelos adenovírus humano e coronavírus murino (HAdV-2 e MHV-3, respectivamente) foram realizados na concentração de 500 µg/mL, não demostrando inativação ou inibição viral. O ensaio bacteriostático conduzido frente à bactéria Listeria monocytogenes apresentou atividade principalmente nas primeiras horas, reduzindo até 60% a divisão bacteriana. O ensaio contra gram-negativas E. coli (ATCC® 11303?) não apresentou redução. Tais compostos e enzimas elencam este fungo como possível fonte de metabólitos secundários com ação para diversos fins, podendo ser explorado a obtenção de novas enzimas e metabólitos secundários em processos e condições otimizados quanto à fatores nutricionais e condições experimentais para fins biotecnológicos.

Abstract: The great demand for new biological assets has stimulated the bioprospecting of new biocompounds from different natural sources, such as endophytic fungi that present genetic and metabolic diversity due to its co-evolution with plants and ecosystems in general. The present study sought to isolate and characterize endophytic fungi from the Florianópolis mangrove, Itacorubi region, selecting plant samples of three species of plants Avicennia schaueriana, Laguncularia racemosa, and Rhizophora mangle. The isolation of fungi was carried out from the root, stem, and leaves of the plants. Among the axenic cultures, the culture of the fungus Neofusicoccum parvum was selected for its accelerated micellar growth to be carried out in solid state fermentation using organic rice as a substrate for 7, 14, and 21 days in order to explore enzymes and secondary metabolites produced there. The fermented ones were chemically macerated with dichloromethane and methanol, and then the crude extract was produced. Chemical characterization in an Ultra Performance Liquid Chromatography system coupled to Mass Spectrometry (Ultra Performance Liquid Chromatography ? Mass Spectrometry - UPLC-MS) allowed the identification of the compounds 2,2'-Dimethyl-3,3'-bi-1, 4-naphthoquinon, belonging to the quinone groups, Radicamine A, Ansellone B, Calanone, Sespendol, and Pestalothiopinon B. From the fermented substrate after 21 days, the analysis of the presence of amylase, cellulase, peroxidase, laccase and lipase enzymes were performed using Sodium phosphate buffer (Na3PO4) at a concentration of 100 mM is adjusted to pH 6 for extraction of the total secretome of enzymes. The main compounds identified by chemical characterization were reported to have varied biological activities, being the quinones with activity: cardioprotective, anti-ischemic, anti-inflammatory, analgesic, bacteriostatic, bactericidal in Gram-negative and Gram-positive bacteria, inhibition of biofilm formation and antiviral. The result of the evaluation of the presence of enzymatic activity was promising for the production of amylase, cellulase and peroxidase, not showing laccase and lipase under these receiving conditions. The extract obtained using organic solvents was submitted to cytotoxicity assays on VERO strains (ATCC CCL-81? - African green monkey kidney fibroblast), A549 (ATCC CCL-185? - human lung cancer) and L929 (ATCC CCL-1? - mouse fibroblast). There was no significant or differential cytotoxicity between the strains tested up to 500 µg/mL. Assays of virucidal and antiviral activity performed with human adenovirus and murine coronavirus models (HAdV-2 and MHV-3, respectively) were performed at a concentration of 500 µg/mL, showing no viral inactivation or inhibition. The bacteriostatic assay conducted against the bacterium Listeria monocytogenes showed activity reducing bacterial division by 60% in the first hours of contact time. The assay against gram-negative E. coli (ATCC® 11303?) showed no reduction. Such compounds and enzymes list this fungus as a possible source of secondary metabolites with action for different purposes, and it can be explored to obtain new enzymes and secondary metabolites in optimized processes and conditions regarding nutritional factors and experimental conditions for biotechnological purposes.