Estudo do efeito protetor de compostos derivados do probucol e de quelantes de ferro frente a diferentes indutores de oxitose/ferroptose em células HT22

Abstract

A oxitose/ferroptose é um tipo de morte celular oxidativa dependente de ferro. Seu papel vem sendo descrito em várias patologias que incluem doenças renais, cardiovasculares e neurodegenerativas. A oxitose/ferroptose pode ser induzida experimentalmente por diferentes agentes como o glutamato (Glu), butionina sulfoxamina (BSO) e RSL3, que atuam em diferentes alvos levando ao aumento de espécies reativas (ER), principalmente as ER lipídicas. Compostos como a ferrostatina -1 (Fer-1) e o quelante de ferro deferoxamina (DFO) apresentam efeitos benéficos contra a oxitose/ferroptose in vitro; porém, não são adequados para uso in vivo. O probucol (PB) é um composto fenólico com atividade antioxidante principalmente relacionada a sua capacidade de aumentar diretamente a atividade da enzima glutationa peroxidase 1 (GPx1), apresentando efeitos protetores em vários modelos oxidativos in vitro e in vivo. Recentemente seus derivados RC363 e RC574 apresentaram efeitos protetores frente aos agentes pró-ferroptose Glu e RSL3. Neste contexto, a fim de propor a utilização dos compostos derivados do PB succinobucol (SUC), RC363 e RC574 como possíveis agentes anti-ferroptóticos, o presente estudo compara o efeito protetor desses compostos com a Fer-1, em um modelo de oxitose/ferroptose em células HT22 induzido por 3 diferentes agentes pró-ferroptose (Glu, BSO, RSL3). Este estudo também compara o efeito protetor de diferentes quelantes de ferro DFO, deferoxamina cafeína (DFCAF), deferiprona (DFP) e o salicilaldeído isonicotinoil hidrazina (SIH) com o objetivo de indicar um quelante de ferro mais adequado para combater a oxitose/ferroptose, sem efeitos colaterais. As células HT22 foram expostas a concentrações crescentes dos agentes pró-ferroptose durante 24h e foram realizados ensaios de viabilidade e morte celular. Foram avaliados a concentração de glutationa (GSH) após 6h e a peroxidação lipídica após 6 e 12h de exposição ao Glu (5 mM), ao BSO (25 µM) ou ao RSL-3 (50 nM). Em outros experimentos, as células foram expostas ao Glu (5 mM), ao BSO (25 µM) ou ao RSL-3 (50 nM) durante 6h e, em seguida, tratadas com os compostos PB e seus derivados (0,5 e 3 µM) ou com os quelantes de ferro DFO, DFCAF, DFP e SIH (0,5 e 3 µM), por 18 horas. Os indutores de ferroptose causaram diminuição da viabilidade celular e morte celular. Além disso, o Glu e o BSO depletaram a GSH e causaram peroxidação lipídica tardia. O composto RSL3 não causou depleção da GSH, porém induziu aumento na peroxidação lipídica de maneira precoce. Os compostos derivados do probucol RC363 e RC574 protegeram da redução na viabilidade celular e da morte induzida pelos três indutores. Esses compostos apresentam efeito anti-ferroptótico superior ao do probucol e semelhante ao da Fer-1, porém esse efeito é perdido quando o excesso de geração de ER lipídicas é estabelecido nas células. Esses resultados sugerem que a peroxidação lipídica é um evento limitante para a proteção contra a oxitose/ferroptose. A ação protetora dos compostos RC363 e RC574 não está relacionada com a síntese de GSH, mas em parte pela sua atividade antioxidante direta. Em relação aos quelantes de ferro, o SIH, composto que apresenta uma boa lipossolubilidade, foi o único quelante com efeito protetor frente ao modelo de oxitose/ferroptose em células HT22. O quelante de ferro SIH reverteu a depleção de GSH induzida pelo Glu além de reduzir a geração de ER citosólicas induzida pelos agentes ferroptóticos Glu, BSO e RSL3, sem apresentar efeito antioxidante direto. Portanto, nossos resultados corroboram a literatura, na qual quelantes lipofílicos apresentam maior potência anti-ferroptótica possivelmente relacionada a sua maior capacidade em bloquear a geração de ER intracelulares dependentes de ferro. Esse trabalho apresenta dois novos derivados do PB com notáveis propriedades protetoras contra três diferentes agentes ferroptóticos além de um quelante de ferro mais eficaz como agente anti-ferroptose.

Abstract: Oxytosis/ferroptosis is a type of iron-dependent oxidative cell death. Its role has been described in several pathologies include renal, cardiovascular, and neurodegenerative diseases. Oxytosis/ferroptosis can be induced experimentally by different agents such as glutamate (Glu), butionine sulfoxamine (BSO) and RSL3, which act on different targets leading to an increase in reactive species (RE), mainly lipid RE. Compounds such as ferrostatin -1 (Fer-1) and the iron chelator deferoxamine (DFO) have beneficial effects against oxytosis/ferroptosis in vitro; however, they are not suitable for in vivo use. Probucol (PB) is a phenolic compound with antioxidant activity mainly related to its ability to directly increase the activity of the enzyme glutathione peroxidase 1 (GPx1), showing protective effects in several oxidative models in vitro and in vivo. Recently, its derivatives RC363 and RC574 showed protective effects against the pro-ferroptosis agents Glu and RSL3. To propose the use of compounds derived from PB succinobucol (SUC), RC363 and RC574 as possible anti-ferroptotic agents, the present study compares the protective effect of these compounds with Fer-1, in an oxytosis/ferroptosis model induced by 3 different pro-ferroptosis agents (Glu, BSO, RSL3) in HT22 cells. This study also compares the protective effect of different iron chelators DFO, deferoxamine caffeine (DFCAF), deferiprone (DFP) and salicylaldehyde isonicotinoyl hydrazine (SIH) to indicate a more suitable iron chelator to combat oxytosis/ferroptosis without side effects. HT22 cells were exposed to increasing concentrations of pro-ferroptosis agents for 24h and cell viability and cell death assays were performed. Glutathione (GSH) concentration after 6h and lipid peroxidation after 6 and 12h of exposure to Glu (5 mM), BSO (25 µM) or RSL-3 (50 nM) were evaluated. Also, cells were exposed to Glu (5 mM), BSO (25 µM) or RSL-3 (50 nM) for 6h and then treated with PB compounds and their derivatives (0.5 and 3 µM) or with the iron chelators DFO, DFCAF, DFP and SIH (0.5 and 3 µM), for 18 hours. Ferroptosis inducers caused decrease cell viability and cell death. In addition, Glu and BSO depleted GSH and caused delayed lipid peroxidation. The RSL3 compound did not cause GSH depletion but induced an early increase in lipid peroxidation. Probucol-derived compounds RC363 and RC574 protected from the reduction in cell viability and death induced by the three inducers. These compounds have an anti-ferroptotic effect superior to probucol and like Fer-1, but this effect is lost when the excess generation of lipid RE is established in the cells. These results suggest that lipid peroxidation is a limiting event for protection against oxytosis/ferroptosis. The protective action of the compounds RC363 and RC574 is not related to the synthesis of GSH, but in part due to their direct antioxidant activity. Regarding iron chelators, SIH, a compound that has good lipid solubility, was the only chelator with protective effects against the oxytosis/ferroptosis model in HT22 cells. The iron chelator SIH reversed the depletion of GSH induced by Glu in addition to reducing the generation of cytosolic RE induced by the ferroptotic agents Glu, BSO and RSL3, without having a direct antioxidant effect. Therefore, it corroborates the literature, in which lipophilic chelators have greater anti-ferroptotic potency, possibly related to their greater ability to block the generation of intracellular RE. These results suggest that lipid peroxidation is a limiting event for protection against oxytosis/ferroptosis. This work also presents two new PB derivatives with remarkable protective properties against three different ferroptotic agents in addition to a more effective iron chelator as an anti-ferroptosis agent.