Padronização de Nested PCR para caracterização molecular de Giardia lamblia e Blastocystis sp. a partir de amostras fecais de crianças da comunidade da Serrinha em Florianópolis – SC

Abstract

Giardia lamblia e Blastocystis sp. estão entre os protozoários mais frequentemente encontrados em amostras fecais humanas e estão entre os principais agentes causadores de diarreia em crianças, principalmente as que vivem em situação de vulnerabilidade hídrica e alimentar. Nos últimos anos, a elevada positividade de Blastocystis sp. em amostras fecais da rotina laboratorial e inquéritos coproparasitológicos, desperta a necessidade de estudos de caracterização molecular para melhor compreensão epidemiológica. Estudos têm demonstrado a implementação de ferramentas moleculares para a compreensão de aspectos epidemiológicos, como a distribuição de subtipos e assembleias de Blastocystis sp. e G. lamblia, respectivamente. Esses protozoários são de transmissão fecal-oral através da água e/ou alimentos contaminados e; também apresentam caráter zoonótico. O conhecimento da ocorrência de parasitoses e a compreensão molecular permite caracterizar o perfil epidemiológico que contemple informações importantes para posterior controle e prevenção das mesmas. Neste sentido, o presente trabalho tem como objetivo realizar a padronização de Nested PCR para identificação e caracterização molecular dos protozoários G. lamblia e Blastocystis sp. a partir de amostras fecais de crianças da comunidade da Serrinha de Florianópolis – SC. Foram selecionadas as amostras fecais positivas por microscopia para G. lamblia e Blastocystis sp., para extração de DNA e otimização das Reações em Cadeia da Polimerase (PCR), resultando na observação da amplificação de regiões conservadas para posterior sequenciamento e classificação das subtipos e assembleias. Os protocolos de PCR utilizados foram de nested PCR, contemplando dois pares de oligonuncleotídeos para cada parasito, sendo: RD3 e RD5 para a primeira PCR de Blastocystis sp. e BsRDsF e BhRDr9R para a segunda PCR, de acordo com Scicluna et al., 2006. Já para G. lamblia, foi utilizado AL3543 e AL3546 para a primeira PCR e para a segunda reação foi utilizado AL3544 e AL3545, de acordo com Sulaiman et al., (2003). Como resultado, foi possível observar produtos de amplificação com fragmentos de tamanhos correspondentes ao esperado e descrito na literatura, mesmo com a utilização de kits de extração não específicos para amostras fecais. As amostras positivas para Blastocystis sp. analisadas por microscopia óptica, obtiveram 84,8% de amplificação por nested PCR. Já as amostras positivas para G. lamblia por microscopia óptica, obtiveram 80% de amplificação por nested PCR. Porém, devido ao tempo reduzido para execução deste trabalho, não foi possível realizar o sequenciamento e caracterização genotípica, deixando para avaliação futura pelo Laboratório de Investigação Aplicada a Protozoários Emergentes (LADIPE) no HU/UFSC. O presente estudo foi o começo de um estudo molecular, que poderá contribuir para maior compreensão da distribuição de assembleias e subtipos dos protozoários estudados, assim como o entendimento epidemiológico e vigilância para futuro controle de fontes de risco que causam insegurança hídrica e alimentar e afetam diretamente a saúde da população.

Giardia lamblia and Blastocystis sp. are among the most frequently found protozoa in human fecal samples and are among the main agents that cause diarrhea in children, especially those living in situations of water and food vulnerability. In recent years, the high positivity of Blastocystis sp. in routine laboratory fecal samples and coproparasitological surveys, raises the need for molecular characterization studies for a better epidemiological understanding. Studies have demonstrated the implementation of molecular tools to understand epidemiological aspects, such as the distribution of subtypes and assemblages of Blastocystis sp. and G. lamblia, respectively. These protozoa are transmitted fecal-orally through contaminated water and/or food and; also have a zoonotic character. The knowledge of the incidence of parasitic diseases and the molecular understanding allows characterizing an epidemiological profile of parasites that includes important information for subsequent control and prevention. In this sense, the present work aims to perform the standardization of Nested PCR for identification and molecular characterization of the protozoa G. lamblia and Blastocystis sp. from fecal samples of children from the community of Serrinha de Florianópolis - SFecal samples positive by microscopy for G. lamblia and Blastocystis sp. were selected for DNA extraction and optimization of Polymerase Chain Reactions (PCR), resulting in the observation of amplification of conserved regions for subsequent sequencing and classification of subtypes and assemblages. The PCR protocols used were nested PCR, contemplating two pairs of oligonucleotides for each parasite, namely: RD3 and RD5 for the first PCR of Blastocystis sp. and BsRDsF and BhRDr9R for the second PCR, according to Scicluna et al., 2006. For G. lamblia, AL3543 and AL3546 were used for the first PCR and for the second reaction, AL3544 and AL3545 were used, according to Sulaiman et al., (2003). As a result, it was possible to observe amplification products with fragment sizes corresponding to those expected and described in the literature, even with the use of non-specific extraction kits for fecal samples. Positive samples for Blastocystis sp. analyzed by optical microscopy, obtained 84.8% amplification by nested PCR. The positive samples for G. lamblia by optical microscopy, obtained 80% amplification by nested PCR. However, due to the reduced time to carry out this work, it was not possible to carry out the sequencing and genotypic characterization, leaving it for future evaluation by the Laboratory of Applied Investigation to Emerging Protozoa (LADIPE) at HU/UFSC. The present study was the beginning of a molecular study, which could contribute to a better understanding of the distribution of protozoan assemblages and subtypes studied, as well as epidemiological understanding and surveillance for future control of risk sources that cause water and food insecurity and directly affect the health of the population.