Expressão de PDL1 em carcinoma de pulmão de células não pequenas com mutações na via KEAP1/NRF2

Abstract

Mutações na via KEAP1/NRF2 ocorrem em cerca de 20-30% dos cânceres de pulmão de células não pequenas e têm sido associadas a um mau prognóstico e resistência a quimioterápicos de primeira linha na doença. Tumores NRF2/KEAP1 mutantes têm se caracterizado como um subtipo molecular de câncer de pulmão, para o qual ainda não se tem uma terapia-alvo disponível. Por outro lado, pacientes com câncer de pulmão com alta expressão de PDL1 foram caracterizados como um subgrupo que responde positivamente a inibidores de checkpoint imunológico (ICI), tais como os anticorpos monoclonais anti-PDL1 e/ou anti-PD1. Neste contexto, uma relação entre a presença de mutações em KEAP1/NRF2 e prognóstico em terapia com ICI foi descrita previamente. Entretanto, não temos estudos abrangentes e funcionais caracterizando a relação entre a expressão de PDL1 e o estado de ativação de NRF2 em tumores pulmonares. Assim, neste estudo, avaliou-se a expressão de PDL1 em tumores com via KEAP1/NRF2 hiperativa e um possível controle dependente de NRF2 da expressão de PDL1 em câncer de pulmão de células não pequenas. Análises in sílico de uma coorte de pacientes do The Cancer Genome Atlas foram utilizadas para avaliar a correlação da expressão de PDL1 e outro gene de resposta a ICI (CTLA4), não demonstrando correlação significativa entre a expressão dos marcadores imune com a presença de mutações na via KEAP1/NRF2, expressão de genes alvo, ou de uma assinatura de ativação de NRF2 previamente validada. Também avaliamos o conteúdo proteico de PDL1, NRF2 e TXNRD1, por imuno-histoquímica, em uma coorte de pacientes diagnosticados com câncer de pulmão, demonstrando alta correlação entre a expressão e conteúdo nuclear de NRF2 e os níveis de seu gene alvo TXNRD1, mas nenhuma associação significativa com PDL1. Além disso, determinamos a expressão de mRNA de PDL1 e três genes-alvos de NRF2, TXNRD1, SLC7A11 e GCLM por RT-qPCR na linhagem A549 mutante KEAP1 com knockdown de NFE2L2 (NRF2), e em células A549 tratadas com inibidor de NRF2 (ML385). Tanto a inibição farmacológica quanto o knockdown de NRF2 não alteraram a expressão de PDL1 em células A549. Embora não associado a expressão de PDL1, a inibição de NRF2 com ML385 inibiu substancialmente o crescimento clonogênico de células KEAP1 mutadas, indicando uma dependência dessa via para a viabilidade celular. Por fim, concluímos que, se a via KEAP1/NRF2 confere resposta diferencial à imunoterapia com ICI em câncer de pulmão de células não pequenas, este processo não parece estar relacionado com a expressão NRF2-dependente de PDL1 nesse tipo tumoral.

Abstract: Mutations in the KEAP1/NRF2 pathway occur in approximately 20-30% of non-small cell lung cancers and have been associated with a poor prognosis and resistance to first-line chemotherapy in the disease. Mutant NRF2/KEAP1 tumors have been characterized as a molecular subtype of lung cancer, for which target therapy is still not available. On the other hand, lung cancer patients with high expression of PDL1 were characterized as a subgroup that respond positively to immune checkpoint inhibitors (ICI), such as anti-PDL1 and/or anti-PD1 monoclonal antibodies. In this context, a relationship between the presence of mutations in KEAP1/NRF2 and prognosis in ICI therapy has been previously described. However, we lack comprehensive and functional studies characterizing the relationship between PDL1 expression and NRF2 activation status in lung tumors. Thus, in this study, we evaluated the expression of PDL1 in tumors with a hyperactive KEAP1/NRF2 pathway and a possible NRF2-dependent control of PDL1 expression in non-small cell lung cancer. In silico analyzes of a cohort of patients from The Cancer Genome Atlas were used to assess the correlation of PDL1 expression and other ICI response gene (CTLA4), not demonstrating a significant correlation between the expression of immune markers with the presence of mutations in the KEAP1/NRF2 pathway, target gene expression, or a previously validated NRF2 activation signature. We also evaluated the protein content of PDL1, NRF2 and TXNRD1, by immunohistochemistry, in a cohort of patients diagnosed with lung cancer, demonstrating a high correlation between the expression and nuclear content of NRF2 and the levels of its target gene TXNRD1, but no significant association with PDL1. In addition, we determined the expression of PDL1 mRNA and three NRF2 target genes, TXNRD1, SLC7A11 and GCLM by RT-qPCR in the A549 mutant KEAP1 cell line with NFE2L2 knockdown (NRF2), and in A549 cells treated with NRF2 inhibitor (ML385). Both pharmacological inhibition and NRF2 knockdown did not alter PDL1 expression in A549 cells. Although not associated with PDL1 expression, inhibition of NRF2 with ML385 substantially inhibited clonogenic growth of mutated KEAP1 cells, indicating a dependence on this pathway for cell viability. Finally, we conclude that, if the KEAP1/NRF2 pathway confers a differential response to ICI immunotherapy in non-small cell lung cancer, this process does not seem to be related to the NRF2-dependent expression of PDL1 in this tumor type.