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Abstract:
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A COVID-19 é uma doença causada por um novo coronavírus designado como síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2). O SARS-CoV-2 é um vírus envelopado com um genoma de RNA de fita simples que se espalha pelas vias do trato respiratório, por gotículas, secreções respiratórias e/ou por contato direto. O vírus possui quatro proteínas estruturais necessárias para regular a função e a estrutura viral. O gene que codifica a proteína S foi o alvo do presente trabalho, pois permite a ligação do vírus aos receptores da superfície da célula hospedeira e subsequente fusão entre as membranas facilitando a entrada do vírus na célula. A utilização de pequeno RNA de interferência (do inglês, small interfering RNAs - siRNAs) como terapia pode controlar infecções virais humanas pela supressão da expressão de um gene viral por meio da inviabilização do RNA mensageiro (mRNA) pela ligação por complementaridade. No entanto, para que esse mecanismo ocorra, são necessários nanocarreadores para a proteção e transporte dos ácidos nucleicos para o interior da célula. Sendo assim, o objetivo principal desse projeto é desenvolver uma nova abordagem terapêutica utilizando siRNAs para o silenciamento do gene codificador da proteína estrutural S do vírus SARS-CoV-2, visando diminuir a replicação do vírus. Para tanto, uma sequência efetiva e específica de siRNA complementar à proteína S do Sars-CoV-2 foi desenhada. Para o desenho do siRNA para o gene que codifica a proteína S, foi utilizada a ferramenta Whitehead siRNA Selection Server. Assim, a sequência que melhor enquadrou-se em critérios propostos para desenho de siRNAs foi UUAAAAUAUAAUGAAAAUGGA. Para eficiente entrega da molécula, sistemas nanoestruturados constituídos por fosfato de cálcio e copolímero de polietileno(glicol)-poliânion foram preparados através da auto associação dos componentes. As nanopartículas foram caracterizadas pela técnica de espalhamento dinâmico de luz (DLS), índice de polidispersão (PdI) e Potencial Zeta no equipamento Zetasizer Nano ZS. As formulações NP-siRNA e mock apresentaram tamanhos com diâmetro médio de 52 nm ± 5 e 61 nm ± e PdI de 0,13 ± 0,04 e 0,12 ± 0,03 respectivamente. A carga superficial das nanopartículas, avaliada pelo potencial zeta, foi de -0,09 ± 0,02 mV para NP-siRNA e -0,03 ± 0,20 mV para mock. Os ensaios de estabilidade indicaram que a formulação manteve-se estável durante 21 dias em temperatura controlada de 4ºC em relação ao tamanho, PdI e potencial zeta. Avaliou-se a citotoxicidade das nanopartículas contendo o siRNA (NP-siRNA) em linhagem celularVero E6 e L929. Não demostrando citotoxicidade até a concentração de 200 nM, nos tempos de incubação de 24h e 48h. A formulação não produziu hemólise. Assim, foi possível preparar nanopartículas a partir de uma técnica simples e de baixo custo, com tamanho, índice de polidispersão e potencial zeta adequados para serem utilizadas na transfecção de siRNA, bem como boa estabilidade e sem apresentar toxicidade para as linhagens celulares testadas. |
