Uso da microextração sortiva em fase têxtil fixado no sistema 96 well plate para determinação de ácidos orgânicos em vinho empregando LC-MS/MS

Abstract

Amostras alimentícias normalmente apresentam matrizes complexas e as metodologias analíticas muitas vezes requerem métodos de preparo de amostras mais elaborados para minimizar interferências nas determinações de compostos de interesse. O efeito de matriz pode estar presente nesses casos, que a complexidade das amostras pode interferir nos resultados, além de prejudicar instrumentos e exigir métodos trabalhosos para a quantificação dos analitos, como calibração por adição de padrão. Para contornar essas questões, este trabalho busca avaliar uma metodologia de preparo de amostra para extração e determinação de ácidos orgânicos alifáticos de cadeia curta em amostras de vinho empregando microextração em fase sólida por filme fino (TFSPME, do inglês Thin Film Solid Phase Microextraction). Os analitos utilizados para averiguação da viabilidade da metodologia proposta foram os ácidos succínico e lático. A proposta de extração, além de contemplar várias vantagens inerentes às técnicas de microextração, explora a interação entre a fase extratora e seu respectivo suporte e seus benefícios, como na maior estabilidade do recobrimento e tempos menores de equilíbrio da extração. No presente trabalho, foram utilizadas hastes flexíveis do tipo swab. A porção de algodão da haste foi o substrato para um filme polimérico em multicamadas de sal amônio quaternário de quitosana e reticulante glutaraldeído. A produção do filme consistiu em mergulhar a porção de algodão da haste em solução de biopolímero (0,2%, m/m) e reticulante (2,5%, v/v) e manter em contato pelo tempo de 20 min, de forma intercalada, totalizando sete camadas e os resultados mostraram uma boa reprodutibilidade na preparação do filme (coeficiente de variação obtido ao comparar as massas das hastes depois de preparado o filme, CV < 7%, n = 8). As hastes foram fixadas em dispositivos como 96 well plate, a fim de conferir ao método alta frequência analítica. Para otimização, foram feitos experimentos multivariados e univariados. As condições experimentais de extração selecionadas incluíram tempo de 30 min, pH de 5,5 e cloreto de sódio adicionado de 10% (m/v). As condições experimentais de dessorção utilizadas foram uma solução composta de ácido clorídrico em pH 1,0 contendo 20% (v/v) de acetonitrila e tempo de dessorção de 20 min. O monitoramento dos analitos foi realizado por LC-MS/MS empregando uma coluna LARIHCCF6- P (5 µm, 150 x 4,6 mm) com eluição no modo gradiente e volume de amostra injetado de 5 µL. Os parâmetros de validação revelaram limites de quantificação para o ácido succínico e ácido lático de 2,63 mg L?1 e 0,35 mg L?1 respectivamente. Os estudos de recuperação e precisão realizados em três níveis de fortificação, revelaram uma variação de 59% a 115% para recuperação e de 10 % a 46% para precisão. A avaliação do efeito de matriz por meio da comparação dos coeficientes angulares das calibrações por adição de padrão e calibrações externas empregando o teste-t, indicaram que não houve efeito de matriz nas quantificações dos dois analitos estudados. O método foi aplicado em amostras de vinho adquiridos do comércio local e mostrou potencial para ser empregado nas extrações e determinações de ácidos orgânicos alifáticos nessas amostras.

Abstract: Food samples that usually present complex matrices and analytical methodologies often require more elaborate sample preparation methods to minimize interferences in the determination of compounds of interest. The matrix effect is often present in these cases, and the complexity of the samples can interfere with the results, in addition to damaging instruments and demanding laborious methods for the quantification of analytes, such as calibration by standard addition. To overcome these issues, this work proposed to evaluate a sample preparation methodology for the extraction and determination of short-chain aliphatic organic acids in wine samples using Thin Film Solid Phase Microextraction (TF-SPME). The analytes used to verify the feasibility of the proposed methodology were succinic and lactic acids. Besides contemplating several advantages inherent to microextraction techniques, the method proposed explores the interaction between the extraction phase and the support and its benefits, such as the stability of the coating and shorter equilibrium time. In the present study, cotton swabs were used as support. The cotton portion was the substrate for a multilayer polymeric film of quaternary ammonium chitosan salt and gluteraldehyde was used as cross-linker. For the preparation of the film, the cotton portion was immersed in a solution of polymer (0.2%, m/m) and kept in contact for 20 minutes, followed by an immersion in a solution of crosslinker (2.5%, v/v) and kept in contact for another 20 minutes. This process was repeated until a coating with a total of seven layers was obtained. The results showed a good reproducibility in the preparation of the film (coefficient of variation obtained when comparing the masses of the swabs after preparing the film, CV<7%, n = 8). The swabs were fixed in devices similar to a 96 well plate to ensure a high throughput extraction method. For optimization, multivariate and univariate experiments were performed and the experimental conditions were selected based on the results. The extraction time selected was 30 min, pH around 5.5 and sodium chloride (10% m/v) was added. For the desorption step a solution of hydrochloric acid at pH 1.0 containing 20% (v/v) acetonitrile was used and the desorption time was 20 min. Analyte monitoring was performed using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) using a LARIHC-CF6-P column (5 µm 150 x 4.6 mm) in gradient mode and an injection volume of 5 uL. Validation parameters revealed quantification limits of 2.63 mgL-1 for succinic acid and 0.35 mgL-1for lactic acid and. The recovery and precision studies were carried out at three levels of fortification, with results showing a variation between 59% and 114% for recovery and 10% and 46% for precision. The matrix effect was evaluated using the t-test to compare the angular coefficients of the calibration curves obtained by standard addition and external calibration. The result indicated that there was no matrix effect in the quantification of the two analytes studied. The method was applied to wine samples purchased in the local market. It showed potential to be applied to the extraction and determination of aliphatic organic acids in these samples.