A influência do óxido nítrico nas alterações patológicas tardias do músculo esquelético ocasionadas pela sepse induzida pelo método Cecal Slurry

Abstract

A sepse é responsável por cerca de 20% de todas as mortes mundiais. Aproximadamente, 40% dos sobreviventes desenvolvem a síndrome pós-sepse, cujos principais problemas estão relacionados com disfunções do músculo esquelético. Essas disfunções impactam tanto a qualidade de vida como a sobrevivência a longo prazo desses indivíduos. O aumento do óxido nítrico (NO) durante a sepse parece ter relação com o desenvolvimento desse dano muscular. Estudos pré-clínicos de sepse utilizam como padrão-ouro o modelo CLP (Cecal Ligation and Puncture) em camundongos, porém, o método Cecal Slurry utilizado para indução de sepse emcamundongos C57BL/6 parece ser mais vantajoso, pela ausência da necessidade de realização de cirurgia e por não ter diferença em relação ao tamanho e quantidade do conteúdo cecal dos animais. Portanto, um dos nossos objetivos foi adaptar o método Cecal Slurry para camundongos Swiss, avaliando parâmetros comumente utilizados para caracterizar a sepse em roedores. Em um segundo objetivo, utilizamos o modelo Cecal Slurry para verificar a influência do NO na miopatia tardia observada no músculo esquelético causada pela sepse. Para este fim, induzimos a sepse pelo método previamente citado, e após 24 h iniciamos o tratamento dos animais com um inibidor não seletivo das óxido nítrico sintases (NOS; L-NAME) e um inibidor seletivo da isoforma neuronal (NOS-1) das NOS (7-NI), com ambas as drogas inibindo seletivamente ou não a produção de NO. Além disso, utilizamos um doador de NO, o nitroprussiato de sódio (SNP), com objetivo de fornecer exogenamente o NO nos animais. Após 10 dias da indução da sepse e tratamento com as drogas realizamos análises morfométricas e imuno-histoquímicas do músculo EDL (extensor digitorum longus). Nossos resultados mostram que o método foi padronizado com sucesso nos animais Swiss, por ter induzido um quadro típico de sepse. Os animais apresentaram hipotermia, redução de peso corporal, diminuição da ingestão alimentar, hipoglicemia, hipotensão e aumento de creatinina nos camundongos sépticos, estatisticamente diferentes dos animais controle. Esse quadro de sepse teve uma taxa de sobrevivência de 25%. As análises do músculo EDL apresentaram alterações patológicas após dez dias da indução da sepse, mais especificamente atrofia, edema e aumento do espaço intersticial entre as miofibras. A realização da imuno-histoquímica para a NOS-1 teve marcações no núcleo, sarcolema e no interior das miofibras. A quantificação da NOS-1 foi estatisticamente menor no grupo tratado com inibidor de NOS. Com isso, nosso trabalho mostra que a indução da sepse pelo método Cecal Slurry ocasionou em alterações patológicas tardias no músculo esquelético, e a inibição não seletiva de NOS parece ter sido o tratamento que mais apresentou dano muscular no EDL, pois sofreu a maior redução da enzima NOS-1 nesse órgão, e em outras miopatias a ausência de NOS-1 está relacionada com um dano muscular maior. Porém, são necessários mais estudos, como a avaliação funcional, para a confirmação desse evento.

Abstract: Sepsis is responsible for about 20% of all deaths worldwide. Approximately 40% of survivors develop post-sepsis syndrome, whose main problems are related to skeletal muscle dysfunction. These dysfunctions impact both the quality of life and the long-term survival of these individuals. The increase in nitric oxide (NO) during sepsis seems to be related with the development of this muscle damage. Preclinical studies of sepsis use the CLP (Cecal Ligation and Puncture) model in mice as the gold standard, however, the Cecal Slurry method used to induce sepsis in C57BL/6 mice seems to be more advantageous, due to the absence of the need for surgery and because there is no difference according to the size and quantity of the animals' cecal content. Therefore, one of our objectives was to adapt the Cecal Slurry method for Swiss mice, evaluating parameters commonly used to characterize sepsis in rodents. In a second objective, we used the Cecal Slurry model to verify the influence of NO on the late myopathy observed in skeletal muscle caused by sepsis. For this purpose, we induced sepsis by the previously mentioned method, and after 24h we started the treatment of the animals with a non-selective nitric oxide synthases inhibitor (NOS; L-NAME) and a selective inhibitor of the neuronal isoform (NOS-1) of NOS (7- NI), with both drugs selectively or not selectively inhibiting NO production. In addition, we used a NO donor, sodium nitroprusside (SNP), with the aim of exogenously supplying NO to the animals. Ten days after sepsis induction and drug treatment, we performed morphometric and immunohistochemical analyzes of the EDL muscle (extensor digitorum longus). Our results show that the method was successfully standardized in Swiss animals, as it induced a typical condition of sepsis. The animals showed hypothermia, reduced body weight, decreased food intake, hypoglycemia, hypotension and increased creatinine in septic mice, statistically different from control animals. This sepsis condition had a 25% survival rate. Analysis of the EDL muscle showed pathological changes ten days after sepsis induction, more specifically atrophy, edema and increased interstitial space between myofibers. Immunohistochemistry for NOS-1 showed markings in the nucleus, sarcolemma and inside the myofibers. NOS-1 quantification was statistically lower expressed in the group treated with NOS inhibitor. Thus, our work shows that the induction of sepsis by the Cecal Slurry method caused late pathological changes in the skeletal muscle, and the non-selective inhibition of NOS seems to have been the treatment that most showed muscle damage in the EDL, as it suffered the greatest reduction in NOS-1 enzyme in that organ, and in other myopathies the absence of NOS-1 is related to greater muscle damage. However, further studies are needed, such as functional evaluation, to confirm this event.