Influência dos genes CTA1 e CTT1 na tolerância ao furfural em Saccharomyces cerevisiae recombinante

Abstract

A obtenção de uma linhagem de Saccharomyces cerevisiae capaz de remediar os efeitos deletérios dos diversos compostos inibidores, formados nos processos de pré-tratamento da biomassa lignocelulósica, ainda é um dos gargalos na produção de etanol de segunda geração. Dentre esses compostos, o furfural ? um aldeído furânico, apresenta-se como um dos mais prejudiciais a essa levedura. Nesse sentindo, a remediação do acúmulo de espécies reativas (ER) causado por esse aldeído, é um dos objetivos para a obtenção de uma cepa robusta e eficiente. Dessa forma, este trabalho teve como hipótese norteadora que o distresse causado por furfural, em S. cerevisiae, pode ser remediado pela superexpressão e/ou deleção das catalases A e T, codificadas pelos genes CTA1 e CTT1, respectivamente. Para isso, foram utilizadas técnicas de engenharia genômica, como a integração de módulos de superexpressão e/ou a deleção, para modificar a expressão da(s) catalase(s) no genoma dessa levedura. Verificou-se que a correta integração do(s) módulo(s) de superexpressão no genoma da levedura, ocasionou o aumento da atividade da(s) catalase(s), tanto nas linhagens laboratoriais como na linhagem industrial recombinante. Por outro lado, onde ocorreu a substituição do(s) gene(s) que codifica(m) a(s) catalase(s) a atividade dessa enzima foi indetectável. A linhagem onde o gene CTA1 estava superexpresso (cepa sCTA1) apresentou significativamente menores níveis de H2O2 e de ER quando comparadas à linhagem parental. Observou-se, ainda, que as linhagens apresentaram diminuição nos níveis dessas enzimas quando crescidas na presença de furfural ou quando a atividade foi avaliada in vitro na presença desse aldeído. Nos crescimentos em microescala, na presença de glicose e furfural, a cepa laboratorial sCTA1 apresentou maior crescimento, em relação a cepa parental, na presença de glicose e furfural. Entretanto, quando crescidas na presença de glicose, xilose e furfural, as linhagens mostraram longa fase lag (? 96h) e não houve diferenças no crescimento celular. Em cofermentações glicose/xilose e furfural a cepa sCTA1 detoxificou esse aldeído mais rápido e, como consequência, consumiu glicose nas primeiras 12 h com velocidade 25% maior que sua cepa parental. Isso refletiu em maior produção de etanol nesse mesmo tempo. Ainda, nas mesmas condições, a linhagem industrial recombinante MPC5H1CA1 apresentou maior consumo de glicose e produção de etanol, nas duas primeiras horas do ensaio fermentativo, se comparadas a linhagem parental. Porém, quando essa linhagem foi submetida a fermentação em hidrolisado lignocelulósico, não foi possível observar claras diferenças no consumo de glicose e xilose e produção de etanol, embora a produção de glicerol foi atenuada, indicando um menor estresse nessas células. Portanto, em conjunto, nossos resultados demonstraram a contribuição da catalase CTA1 na tolerância ao furfural em linhagens de S. cerevisiae.

Abstract: Obtaining a strain of Saccharomyces cerevisiae capable of remedying the harmful effects of the various inhibitory compounds formed in the pre-treatment processes of lignocellulosic biomass still is one of the bottlenecks in the production of second-generation ethanol. Among these compounds, furfural ? a furan aldehyde, is one of the most harmful to this yeast. In that case, the prescription of the accumulation of reactive species (RE) caused by this aldehyde is one of the alternatives to obtain a robust and efficient strain. Thus, this work had as a guiding hypothesis the potential of the overexpression and/or deletion of catalases A and T (encoded by CTA1 and CTT1 genes, respectively) to remedy the distress caused by furfural in S. cerevisiae. To do that, genomic engineering techniques were used, such as integrating overexpression modules and/or replacing catalase(s) in the genome of this yeast. It was verified that the correct integration of the overexpression module(s) in the yeast genome caused an increase in the catalase(s) activity, both in laboratory and industrial strains. On the other hand, when the catalase genes were, enzyme activity was undetectable. The strain in which the CTA1 gene was overexpressed (sCTA1 strain) had significantly lower levels of H2O2 and ER when compared to the wild-type strain. It was also observed that the strains showed a decrease in the levels of these enzymes when grown in the presence of furfural or when the activity was evaluated in vitro with this aldehyde. In microscale growth, the sCTA1 strain showed greater growth than the parental strain in the presence of glucose and furfural. Despite growing in the presence of glucose, xylose, and furfural, the strains showed a long lag phase (? 96h), and there was no difference in cell growth. In co-fermentation with glucose/xylose and furfural, the sCTA1 strain detoxified this aldehyde faster and, consequently, consumed glucose in the first 12 hours at a rate 25% higher than its parental strain. This was reflected in higher ethanol production at the same time. Also, under the same conditions, the strain MPC5H1CA1 showed higher glucose consumption and ethanol production in the first two hours of the fermentation assay if compared to the parental strain. However, when this strain was submitted to fermentation in lignocellulosic hydrolysate, it was impossible to observe apparent differences in glucose and xylose consumption and ethanol production, although glycerol production was attenuated, indicating less stress in these cells. Therefore, altogether, our results demonstrated the contribution of CTA1 catalase to furfural tolerance in S. cerevisiae strains.