Estudo comparativo das características biológicas, da transcrição de genes de suscetibilidade à miltefosina e do proteoma de isolados de Leishmania (L.) infantum de cães do município de Florianópolis, Santa Catarina

Abstract

A leishmaniose visceral (LV) é uma antropozoonose endêmica em franca expansão e urbanização no Brasil onde o cão doméstico é o principal reservatório do parasito. No município de Florianópolis, entre 2010 e 2021, foram registrados mais de 700 casos autóctones de LV em cães e três casos em humanos. O objetivo deste trabalho foi estudar cepas de L. infantum isoladas de cães naturalmente infectados, antes (T0) e depois (T1) do tratamento com Milteforan. Os seguintes parâmetros foram avaliados: curva de crescimento, infectividade frente a linhagem celular THP-1, determinação in vitro da CI50 da miltefosina, avaliação da transcrição de genes associados a suscetibilidade a miltefosina, identificação do perfil proteômico na presença e ausência de miltefosina in vitro e predição os epítopos lineares específicos de células B. A cinética de crescimento entre as cepas isoladas de cães foi similar e distinta da cepa PP75. As cepas isoladas antes e depois do tratamento in vivo mostraram capacidade infectiva in vitro distinta. Os valores de CI50 da miltefosina para as cepas de cada cão em T0 e T1, não apresentaram diferença, tanto para as formas amastigotas intracelulares quanto para as promastigotas. A transcrição dos genes associados a suscetibilidade a miltefosina revelou modulação dos transcritos em formas promastigotas das cepas tratadas com miltefosina. Nenhuma das cepas mostrou perfil gênico de resistência a miltefosina em nível de sequência nucleotídica e aminoacídica dos genes LiMT e LiRos3. Identificou-se, nas seis cepas nas diferentes condições experimentais, um total de 494 proteínas únicas de L. infantum, em 99% destas, foi possível identificar a função. A localização subcelular principal foi citoplasmática (44,33%), seguida da mitocondrial (19,9%). A análise mostrou que 2% das proteínas possuem peptídeo sinal e 7,3% possuem ao menos um domínio transmembranar. O PCA do proteoma mostrou grupos separados, mas com aproximadamente 70% das proteínas compartilhadas entre as cepas do mesmo cão com e sem tratamento. Entre as seis cepas, 225 proteínas únicas foram compartilhadas nas diferentes condições experimentais. As proteínas, com significativa abundância diferencial, não demonstraram alteração de nenhuma proteína associada com o mecanismo de ação ou de resistência a miltefosina. Identificou-se seis epítopos de célula B de cinco proteínas compartilhadas entre as cepas e as espécies de Leishmania sp. e um epítopo exclusivo de L. infantum. As cepas dos três cães mostraram variações intrínsecas no comportamento biológico, mas não apresentaram fenótipo nem genótipo de resistência à miltefosina.

Abstract: Visceral leishmaniasis (VL) is an expanding endemic anthropozoonosis in Brazil where the domestic dog acts as the main reservoir of the parasite. Between 2010 and 2021, more than 700 autochthonous cases of VL in dogs and three human cases were recorded in the city of Florianópolis, southern Brazil. The aim of this study was to assess biological parameters of L. infantum isolated from naturally infected dogs in this city, before (T0) and after (T1) treatment with Milteforan. The following parameters were evaluated: growth curve, infectivity for THP-1 cell line, in vitro determination of IC50 for miltefosine, transcription of genes associated with susceptibility to miltefosine, proteomic profile before and after treatment with miltefosine in vitro and prediction of specific B-cell linear epitopes. The growth kinetics between strains isolated from dogs was similar and distinct from the PP75 reference strain. Strains isolated before and after in vivo treatment showed distinct infectivity in vitro. No differences were observed on the miltefosine IC50 for both intracellular amastigotes and promastigotes (T0 and T1). The transcription of genes associated with susceptibility to miltefosine revealed a positive modulation of transcripts in promastigote forms treated with miltefosine. We have not observed a genetic resistance profile to miltefosine based on the LiMT and LiRos3 genes. A total of 494 unique proteins of L. infantum were identified on six strains at different experimental conditions, achieving functional annotation for 99% of them. The main subcellular localizations observed were cytoplasmic (44.33%) and mitochondrial (19.9%). Among these, 2% contain signal peptides and 7.3% contain at least one transmembrane domain. Although ~70% of the proteins were shared between strains from a single dog with and without treatment, PCA analysis indicates some differential clustering. Among the six strains, 225 unique proteins were shared in the different experimental conditions. Proteins showing significant differential abundance are not related to any known biological mechanism related to miltefosine. Only a single, exclusive B cell epitope of L. infantum was observed among the six B cell epitopes detected from five distinct Leishmania sp. Although intrinsic variations in biological behavior of the strains from these dogs were observed, no evidence of phenotypic or genotypic-related aspects of resistance to miltefosine were detected.