Análises in silico para investigação de agentes inflamatórios em células das vias aéreas infectadas com sars-cov-2 e reposicionamento de fármacos para a COVID-19

Abstract

A COVID-19 é uma doença viral sistêmica causada pelo SARS-CoV-2, a qual tornou-se responsável pela recente pandemia que infectou milhões de pessoas no Brasil e no mundo. Em seu estágio grave, a COVID-19 gera um quadro de insuficiência respiratória resultado de um evento denominado tempestade inflamatória. Para melhor compreender o microambiente de infecção, a biologia de sistemas junto do sequenciamento de RNA em células únicas (scRNA-seq) compõem ferramentas promissoras na área. O objetivo deste trabalho busca identificar marcadores biológicos e fatores de transcrição associados com a inflamação na COVID-19, a partir de análises in sílico de células infectadas das vias aéreas superiores (NS) e inferiores (BALF), para eleição de opções terapêuticas. A metodologia utilizou-se de dados de amostras disponíveis em bancos de dados de scRNA-seq, com análises conduzidas no RStudio utilizando o pacote de programação FUSCA e os algoritmos do CellRouter e Celcomm, além dos recursos do DrugBank para o reposicionamento de fármacos. Utilizando o CellRouter, foram identificados 24 clusters celulares para NS e 19 para o BALF, sendo o cluster FOXN4 específico para amostras infectadas. Os genes diferencialmente expressos revelaram células ciliadas anômalas envolvidas com a inflamação, assim como a expressão de MUC5AC/MUC5B, potenciais alvos para o anti-inflamatório ibudilast. A inferência da trajetória celular apresentou em sua maioria genes envolvidos na diferenciação celular (FOXJ1), com predominância em células infectadas. Nas células imunológicas várias citocinas/quimiocinas foram expressas, como IL-8, IL-17A, IL-1ß, CCL5 (associado à linfopenia) e CXCL10 (indutor apoptótico), sugerindo o uso de fármacos inibidores de interleucinas, como o ixekizumab e o reparixin. Nesse contexto, o emricasan é um fármaco inibidor da CASP3 identificado com possível aplicação clínica. A relativa baixa expressão de ACE-2 pode ser justificada pelo estímulo de interferons (via STAT1) e da co-dependencia de CTSL/TMPRSS2 para sua total funcionalidade, evidenciando o fostamatimib como fármaco de interesse (inibidor de CTSL). Já para os genes do extravasamento vascular, destacou-se o VEGFA e o ITGB1, envolvidos na intercomunicação de células imunológicas. Utilizando o CellComm, observou-se as interações celulares entre grupos, com maior intensidade entre macrófagos e neutrófilos no BALF. Vários pares de ligante-receptores foram destacados para NS, como o CCL5/CCR1, de ação pró-inflamatória, com outros alvos em potencial ainda pouco explorados. Para o BALF destacou-se o ANXA1/FPR1, o NAMPT/INSR, além de outros pares potenciais. Dada a importância do CCL5/CCR1, o cenicriviroc foi apontado como um antiviral de possível aplicabilidade. Os principais fatores de transcrição previstos para NS foram o RUVBL2 (respostas pró-inflamatórias de macrófagos) em células ciliadas, e o HMGB1 (inibição da fagocitose e regulação de IL-1ß.) em nrMa. Logo, o fármaco anakinra foi proposto devido sua função inibitória de IL-1. Já no BALF, pode-se destacar para células secretoras o fator EGFR, enquanto que para os macrófagos o fator NLRP3, ambos agindo na inflamação e tendo como fármacos propostos o dapansutrile (anti-NLRP3) e o nimotuzumab (anti-EGFR). Esses resultados auxiliam a compreender a complexidade celular sob infecção do SARS-CoV-2, aprofundando sobre as interações celulares para a eleição de agentes com potencial terapêutico, e estabelecendo relações a serem exploradas em futuras pesquisas.

Abstract: COVID-19 is a systemic disease caused by SARS-CoV-2 virus which became responsible for the recent pandemic that infected millions of people people worldwide. In its severe stage, COVID-19 generates respiratory failure as a result of an event called inflammatory storm. To better understand the microenvironment of infection, systems biology together with single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) constitute promising tools in the area. The aim of this project seeks to identify gene markers and transcription factors associated with inflammation in COVID-19, based on analyzes in silica of infected cells from the upper (NS) and lower (BALF) airways, for the selection of therapeutic targets. The methodology used data from samples available in scRNA-seq databases, with analyzes conducted in RStudio using the FUSCA programming package and the CellRouter and Celcomm algorithms, in addition to DrugBank resources for drug repositioning. Using CellRouter, 24 cell clusters were identified for NS and 19 for BALF, with the FOXN4 cluster being specific for infected cells. The differentially expressed genes revealed anomalous ciliated cells involved in inflammation, as well as the expression of MUC5AC/MUC5B, potential targets for the anti-inflammatory drug ibudilast. The inference of the cell trajectory showed mostly genes involved in cell differentiation (FOXJ1), with predominance in infected cells. In immune cells, several cytokines/chemokines were expressed, such as IL-8, IL-17A, IL-1ß, CCL5 (associated with lymphopenia) and CXCL10 (apoptotic inducer), suggesting the use of interleukin inhibitor drugs, such as ixekizumab and or reparixin. In this context, emricasan is a CASP3 inhibitor drug identified with possible clinical application. The relative low expression of ACE-2 can be explained by the stimulation of interferons (via STAT1) and the co-dependency of CTSL/TMPRSS2 for its complete functionality, highlighting fostamatimib as a drug of interest (CTSL inhibitor). As for the vascular extravasation genes, it can be pointed VEGFA and ITGB1, involved in intercommunication of immune cells. Using CellComm, cellular interactions were observed between groups, with greater intensity between macrophages and neutrophils in BALF. Several pairs of ligand-receptors were highlighted for NS, such as CCL5/CCR1, with pro-inflammatory action, with other potential targets still little explored. For BALF, it was highlighted ANXA1/FPR1, NAMPT/INSR, and other potential pairs. Given the importance of CCL5/CCR1, cenicriviroc was identified as an antiviral with possible applicability. The main predicted transcription factors for NS were RUVBL2 (pro-inflammatory macrophage responses) in ciliated cells, and HMGB1 (inhibition of phagocytosis and IL-1ß regulation.) in nrMa. Therefore, the drug anakinra was proposed due to its IL-1 inhibitory function. In BALF, the EGFR factor can be highlighted for secretory cells, while for macrophages it can be the NLRP3 factor, both acting in inflammation and having as proposed drugs dapansutrile (anti-NLRP3) and nimotuzumab (anti-EGFR). These results help to understand the cellular complexity under the SARS-CoV-2 infection, deepening the cellular interactions for the election of drugs with therapeutic potential, and establishing features to be explored in future research.