Imobilização de bromelina e papaína em óxido de grafeno: avaliação do derivado enzimático como agente antimicrobiano e na biotransformação de tetraciclinas

Abstract

Neste estudo foi sintetizado e caracterizado óxido de grafeno (OG) para imobilização das proteases bromelina e papaína para aplicação como agente antimicrobiano e na biotransformação de tetraciclinas. A obtenção de OG foi realizada pelo método de Hummers modificando a etapa de filtração por liofilização. O OG foi caracterizado quimicamente pela determinação dos elementos químicos, das ligações e dos grupos funcionais, oxidação do grafite em OG, cristalinidade e estabilidade da suspensão. A caracterização microestrutural foi realizada por imagens de microscopia eletrônica de varredura e de transmissão. Os derivados enzimáticos foram obtidos imobilizando-se bromelina (B) e papaína (P) em óxido de grafeno (B-OG e P-OG) e em óxido de grafeno funcionalizado com glutaraldeído (B-OG-Glu e P-OG-Glu) a 25 °C e pH 7. Foram estudadas 3 diferentes razões m/m (1:1; 2:1 e 3:1) de enzima mantendo-se constante a massa de OG e o volume da solução. Ambos os processos de imobilização atingiram o equilíbrio de imobilização em 30 min e, a razão 1:1 teve toda a massa de enzima inicial transferida para o OG independente da enzima. A caracterização das enzimas livres e seus derivados enzimáticos mostrou que a temperatura de 50 °C foi a melhor para a atividade enzimática, enquanto o pH variou entre 6 para B-OG e P-L, e 7 para bromelina livre, B-OG-Glu, P-OG e P- OG-Glu. Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (MET) mostraram presença das enzimas nas nanofolhas de OG. As enzimas e seus derivados possuem estabilidade térmica a 50 °C por no mínimo 4 h e, melhor desempenho de estabilidade de estocagem a 4 °C, de 14 dias para a bromelina livre e 24 dias para P-OG-Glu mantendo 50% da atividade inicial. Quanto ao reúso, B-OG e B-OG-Glu mantiveram 50% de atividade por 5 e 2 ciclos, e P-OG e P-OG-Glu por 4 ciclos, respectivamente. Parâmetros cinéticos segundo modelo de Michaelis-Menten indicam aumento da afinidade entre substrato e enzima quando imobilizadas com glutaraldeído. As enzimas livres e B-OG e P-OG obtiveram resultados promissores como agentes antimicrobianos contra Escherichia coli em ensaios realizados a 25 °C em meio BHI em pH 7 e em suco comercial de maçã em pH 4. Em todas as análises em meio BHI e em suco utilizando os derivados foi observado Fenômeno Fênix e que o OG possui comportamento sinérgico com as enzimas, retardando o desenvolvimento das células bacterianas. As análises em suco mostraram menor ação antimicrobiana das enzimas quando comparadas ao meio BHI. Ambos os derivados enzimáticos apresentam resultados promissores como agente antimicrobiano. Ao serem aplicados como agentes biotransformadores de tetraciclinas, as enzimas livres e seus derivados não obtiveram desempenho satisfatório, obtendo no máximo 18% de biotransformação da tetraciclina após 10 h utilizando bromelina livre em pH 6 a 25 °C. O efeito da temperatura na biotransformação foi analisado com cinética a 40 °C. Os fármacos se mostraram susceptíveis a hidrólise térmica evidenciado pelo escurecimento da solução dos fármacos, principalmente da oxitetraciclina. Assim, o desenvolvimento dos derivados de bromelina e papaína é viável, sua aplicação como agente antimicrobiano é satisfatório. Quanto a biotransformação de tetraciclinas se faz necessária uma maior investigação.

Abstract: In this study, graphene oxide (GO) was synthesized and characterized for the immobilization of bromelain and papain proteases as an antimicrobial agent and in the biotransformation of tetracyclines. The GO was obtained by the modified Hummers method, with the filtration step being replaced by lyophilization. The GO was chemically characterized by determining the chemical elements, bonds, and functional groups, graphite oxidation to GO, crystallinity, and suspension stability. Microstructural characterization was performed using scanning and transmission electron microscopy images. The enzyme derivatives were obtained by immobilizing bromelain (B) and papain (P) on graphene oxide (B-OG and P-OG) and graphene oxide functionalized with glutaraldehyde (B-OG-Glu and P-OG-Glu) at 25°C and pH 7. Three different enzyme-to-OG mass ratios (1:1, 2:1, and 3:1) were studied, keeping the OG mass and solution volume constant. Both immobilization processes reached immobilization equilibrium within 30 min, and the 1:1 ratio resulted in all initial enzyme mass being transferred to the OG, regardless of the enzyme. Characterization of the free enzymes and their enzyme derivatives showed that the optimal temperature for enzymatic activity was 50°C, while the pH varied between 6 for B-OG and P-L, and 7 for free bromelain, B-OG-Glu, P-OG, and P-OG-Glu. Transmission electron microscopy (TEM) images showed the presence of enzymes on the nanosheets of OG. The enzymes and their derivatives had thermal stability at 50°C for at least 4 h and better storage stability performance at 4°C, with free bromelain maintaining 50% of initial activity for 14 days, and P-OG-Glu for 24 days. Regarding reuse, B-OG and B-OG-Glu maintained 50% of activity for 5 and 2 cycles, respectively, while P-OG and P-OG-Glu maintained it for 4 cycles. Kinetic parameters, according to the Michaelis-Menten model, indicate an increase in substrate-enzyme affinity when immobilized with glutaraldehyde. Free enzymes and B-OG and P-OG showed promising results as antimicrobial agents against Escherichia coli in assays performed at 25°C in BHI medium at pH 7 and in commercial apple juice at pH 4. In all BHI and juice assays using the derivatives, the Phoenix Phenomenon was observed, and OG exhibited synergistic behavior with the enzymes, delaying the development of bacterial cells. The analyses in juice showed lower antimicrobial action of the enzymes compared to BHI broth. Both enzymatic derivatives show promising results as antimicrobial agents. However, when applied as biotransformation agents for tetracyclines, the free enzymes and their derivatives did not perform satisfactorily, achieving a maximum of 18% tetracycline biotransformation after 10 hours using free bromelain at pH 6 and 25 °C. The effect of temperature on biotransformation was analyzed with kinetics at 40 °C. The drugs proved susceptible to thermal hydrolysis, evidenced by the darkening of the drug solution, especially oxytetracycline. Thus, the development of bromelain and papain derivatives is viable, and their application as antimicrobial agents is satisfactory. Further investigation is needed regarding the biotransformation of tetracyclines.