Avaliação da senescência replicativa das células estromais mesenquimais do tecido adiposo de felinos durante a amplificação in vitro

Abstract

Nos últimos anos, observou-se um crescente interesse pela utilização de células estromais mesenquimais (CEM) como estratégia terapêutica em animais de companhia, principalmente em cães e gatos. Um fator indispensável para o transplante de CEM durante a terapia celular é o grande número de células, o qual é alcançado por amplificação celular in vitro. No entanto, sabe-se que a amplificação prolongada in vitro pode ocasionar acúmulo de dano celular associado à senescência. Portanto, para garantir a eficácia do tratamento e estabelecer protocolos seguros para utilização das CEM em aplicação terapêutica é necessário um aprofundamento na pesquisa básica, contemplando estudos controlados das características e das propriedades biológicas das CEM. Sendo assim, o presente trabalho buscou avaliar o efeito da técnica de amplificação celular in vitro sobre as características das CEM do tecido adiposo de felinos, visando a análise de senescência replicativa. Para isso, as CEM do tecido adiposo de felinos (CEM-TAF), excedentes de excedentes de cirurgia de castração, foram previamente explicados e especificados quanto ao perfil mesenquimal. Os dados patogênicos que as CEM-TAF pediátricas neste trabalho apresentaram perfil mesenquimal, por meio de morfologia fibroblastóide, presença de marcador de superfície mesenquimal (CD90) e ausência de marcadores hematopoiéticos (CD45 e CD34), e pela capacidade de diferenciação das células em fenótipos mesenquimais. A seguir, foi avaliado o efeito da amplificação celular in vitro sobre parâmetros de senescência celular. Para isso, as CEM-TAF foram deixados ao cultivo de passagem 1 (P1) a passagem 7 (P7), e as suas propriedades foram caçadores ao longo das passagens. Os resultados satisfatórios que as CEM-TAF apresentaram aumento no número de células hipertróficas e achatadas com o aumento do número de passagens, e tendência de diminuição no potencial proliferativo acompanhado pela redução da capacidade clonogênica em passagens tardias. Além disso, foi observado aumento do número de células positivas para SAß-gal e da proporção de células com modificações em passagens tardias. As análises de ciclo celular provocaram uma tendência de aumento na proporção de CEM-TAF na fase G1/G0 do ciclo celular e diminuição na fase S em P5 e P7. Em adição, as análises de alterações químicas e ciclo celular produziram aumento da proporção de células em apoptose durante o cultivo de longo prazo. Esses resultados sugerem que a técnica de amplificação celular in vitro por tempo prolongado afeta características importantes das CEM-TAF, que são necessárias para o sucesso da aplicação terapêutica, o que pode comprometer seriamente a segurança e eficácia da utilização dessas células na medicina veterinária regenerativa .

Abstract: In recent years, there has been a growing interest in the use of mesenchymal stromal cells (MSC) as a therapeutic strategy in companion animals, mainly dogs, and cats. An indispensable factor for MSC transplantation during cell therapy is the large number of cells achieved by cell amplification in vitro. However, prolonged amplification in vitro can cause an accumulation of cell damage associated with senescence. Therefore, to guarantee treatment efficacy and establish safe protocols for MSC use in therapeutic applications, it is necessary to deepen basic research, including controlled studies of MSC characteristics and biological properties. Thus, the present work evaluated the effect of the in vitro cellular amplification technique on feline adipose tissue-derived MSC (DSC) characteristics, focusing on replicative senescence. In this way, MSC from feline adipose tissue obtained from castration surgery was previously isolated and characterized according to the mesenchymal profile. The data obtained demonstrated that the feline DSC isolated in this work presented a mesenchymal profile through fibroblastic morphology, the presence of mesenchymal surface marker (CD90) and absence of hematopoietic markers (CD45 and CD34), and the ability of cells to differentiate into mesenchymal phenotypes. Next, was evaluated the effect of in vitro cell amplification on cell senescence parameters. Then, feline DSC was cultivated from passage 1 (P1) to passage 7 (P7), and their properties were analyzed along the passages. The results showed that feline DSC showed an increase in the number of hypertrophic and flattened cells with an increase in the number of passages and a tendency towards a decrease in the proliferative potential accompanied by a reduction in the clonogenic capacity in late passages. Furthermore, an increase in the number of cells positive for SA-ß-gal and the proportion of cells with nuclear alterations in late passages was observed. Cell cycle analyses showed a trend towards an increase in the feline DSC ratio in the G1/G0 phase of the cell cycle and a decrease in the S phase at P5 and P7. In addition, analyses of nuclear and cell cycle changes demonstrated an increase in the proportion of cells undergoing apoptosis during long-term culture. These results suggest that in vitro cell amplification for a long time negatively affects important characteristics of feline DSC and can seriously compromise the safety and efficacy of MSC use in regenerative veterinary medicine.