Mecanismos de resistência inata e induzida por Saccharomyces cerevisiae, frações polissacarídicas de babosa e acibenzolar-S-metil em plantas de pimentão a xanthomonas euvesicatoria pv. euvesicatoria

Abstract

O pimentão (Capsicum annuum L.), pertencente à família Solanáceae, é uma das hortaliças mais cultivadas no Brasil, com uma produção de 224.286 toneladas e estabelecida em aproximadamente 13 mil hectares. Dentre os problemas fitossanitários que afetam essa cultura se encontra a mancha foliar causada pela bactéria Xanthomonas euvesicatoria pv. euvesicatoria, que compromete a produção, já que afeta a planta em qualquer fase de seu desenvolvimento. O controle desta bacteriose baseia-se principalmente na implementação de cultivares resistentes e no uso de produtos de proteção fitossanitária à base de cobre em combinação com antibióticos, produtos que intensificam a pressão de seleção de bactérias resistentes, acarretando problemas econômicos, ecológicos e à saúde humana. Uma alternativa para controlar essa bacteriose na cultura de pimentão é a indução de resistência, por meio da ativação dos mecanismos de defesa da planta, mediante o uso de produtos de baixo impacto ambiental, como a levedura do fermento Saccharomyces cerevisiae ou a babosa (Aloe barbadensis). Dessa maneira, os objetivos desta pesquisa foram elucidar os mecanismos de resistência ativados em diferentes cultivares de pimentão para resistir ao ataque da mancha bacteriana causada por X. euvesicatoria pv. euvesicatoria e avaliar o efeito protetor e o modo de ação de suspensões celulares de S. cerevisiae e de frações polissacarídicas da babosa no controle dessa doença. Para elucidar quais mecanismos de resistência são ativados em diferentes cultivares de pimentão, foram utilizadas plantas das cultivares All Big, Yolo Wonder e Amarelo SF. Plantas das diferentes cultivares foram inoculadas com o isolado 112-P de X. euvesicatoria pv. euvesicatoria (A600 nm = 0,6) e 14 dias após da inoculação (DAI), a cada 7 dias e por um período de 28 dias foi avaliada visualmente a severidade dos sintomas causados pela bactéria. Em outro grupo de plantas das mesmas cultivares e inoculadas da mesma maneira, foi analisada a atividade de enzimas de defesa guaiacol de peroxidase (POX), catalase (CAT), polifenoloxidase (PFO), lipoxigenase (LPOX) e fenilalanina amônia-liase (FAL), o conteúdo de compostos fenólicos e flavonoides, o número de estômatos apresentando reação de hipersensibilidade (RH), o número de células exibindo acúmulo de calose, e os teores de clorofila a, b e carotenóides. Inicialmente, foi observado que as plantas da cultivar mais suscetível, All Big, apresentaram maiores atividades das enzimas POX e PFO, maior acúmulo de calose e maior teor de clorofila a. Ao passo, foi observado um aumento na atividade da enzima CAT na cultivar Yolo Wonder e da enzima LPOX na cultivar Amarelo SF, nesta última também se encontrou o maior número de células com reação de hipersensibilidade. Ainda foi observado que as plantas da cultivar All Big apresentaram um teor de clorofila a superior ao das plantas Amarelo SF e Yolo Wonder. No entanto, não foram observadas diferenças significativas no teor de carotenoides nas plantas das diferentes cultivares. Por outro lado, para avaliar o efeito protetor e o modo de ação de suspensões celulares de Saccharomyces cerevisiae no controle dessa doença, plantas de pimentão da cultivar Rubi Gigante foram pulverizadas com uma suspensão de S. cerevisiae (8 x 107 células mL-1) e 3 dias após desafiadas com X. euvesicatoria pv. euvesicatoria (0,6 U.A. a 600 nm). Como controle negativo as plantas foram pulverizadas com água destilada e como controle positivo foram pulverizadas com o indutor Bion® (acibenzolar-S-metil - ASM) a 50 ppm do ingrediente ativo. Foi avaliada a severidade da mancha bacteriana, e a atividade de enzimas de defesa POX, CAT, PFO, FAL, e do teor de clorofila a, b e carotenóides. Posteriormente, este experimento foi repetido e conduzido da mesma maneira, porém utilizando a cultivar All Big, a qual apresenta maior suscetibilidade que Rubi Gigante. Neste experimento a suspensão de S. cerevisiae reduziu a severidade da mancha bacteriana em até 20% e ativou a enzima catalase (CAT) na cultivar Rubi Gigante, enquanto na cultivar All Big a reduziu em até 35%, e ativou as enzimas peroxidase (POX) e polifenoloxidase (PFO). Já o ASM reduziu a doença em até 40% na cultivar Rubi Gigante e em até 85% na cultivar All Big, e ativou as enzimas fenilalanina amônia-liase (FAL), POX e PFO somente na Rubi Gigante. Finalmente, foi avaliado o efeito de duas frações polissacarídicas de babosa na redução da mancha bacteriana, uma fração de coloração branca (Bab FB) e outra de coloração rosa (Bab FR), ambas obtidas através de precipitação etanólica do gel de folhas de babosa. Primeiramente, plantas de pimentão cv. Rubi Gigante foram pulverizadas com a Bab FB a 0,5, 1,5 e 3 mg/mL, autoclavadas a 120°C por 20 minutos, e aplicada nas plantas 3 dias antes da inoculação (DAi) com X. euvesicatoria pv. euvesicatoria. Posteriormente, no intuito de saber qual modo de preparo das frações é mais eficiente para reduzir os sintomas da doença, ambas as frações foram submetidas a diferentes temperaturas e tempos de aquecimento (30 min a 100°C, 20 min a 120°C ou 30 min a 60°C) e aplicadas 3 dias antes da inoculação. Finalmente foi verificada a influência do intervalo de aplicação da Bab FB e da Bab FR a 3 mg/mL (aquecidas por 30 minutos a 100°C), aplicadas 3 ou 7 dias antes da inoculação, e comparadas com o indutor ASM a 50 ppm do ingrediente ativo. Primeiramente, foi observado que, a Bab FB a 0.5, 1.5 e 3 mg/mL e aquecida a 120°C por 30 minutos não reduziu a severidade da doença. Contudo, foi observado que a Bab FB e a Bab FR, ambas a 3 mg/mL e aquecidas por 30 minutos a 100°C, reduziram a severidade da doença aos 28 e 21 dias após a inoculação (DAI). No entanto, no seguinte experimento quando a Bab FB e a Bab FR, ambas a 3 mg/mL, foram aquecidas a 100°C por 30 minutos e aplicadas 3 ou 7 dias antes da inoculação não reduziram significativamente a severidade dos sintomas de mancha bacteriana. Pelo contrário, o ASM sempre reduziu significativamente a severidade da doença. Com os resultados do presente estudo se conclui que a atividade de CAT, LPOX e o acúmulo de células com reação de hipersensibilidade estão envolvidos na resistência inata de pimentao a X. euvesicatoria pv. euvesicatoria. Por outro lado, se conclui que a levedura S. cerevisiae e o ASM apresentam potencial para auxiliar no manejo da doença.

Abstract: Bell pepper (Capsicum annuum L.), belonging to the Solanaceae family, is one of the most cultivated vegetables in Brazil, with a production of 224,286 tons and established in approximately 13 thousand hectares. The leaf spot caused by the bacterium Xanthomonas euvesicatoria pv. euvesicatoria is among the phytosanitary problems that affect this crop, which compromises production, as it affects the plant at any stage of its development. The control of this bacteriosis is based mainly on the implementation of resistant cultivars and the use of plant protection products based on copper in combination with antibiotics that intensify the selection pressure of resistant bacteria, causing economic, ecological and human health problems. An alternative to control this bacterioses in the sweet pepper culture is the induction of resistance, through the activation of the plant's defense mechanisms, through the use of products with low environmental impact, such as yeast Saccharomyces cerevisiae or aloe vera (Aloe barbadensis). Thus, the objectives of this research are to elucidate the resistance mechanisms activated in different pepper cultivars to resist the attack of bacterial leaf spot caused by X. euvesicatoria pv. euvesicatoria and evaluate the protective effect and mode of action of cell suspensions of S. cerevisiae and aloe polysaccharide fractions in controlling this disease. To elucidate which resistance mechanisms are activated in different bell pepper cultivars, plants of the All Big, Yolo Wonder and Amarelo SF cultivars were used. Plants of different cultivars were inoculated with the 112-P isolate of X. euvesicatoria pv. euvesicatoria (A600 nm = 0.6) and 14 days after inoculation (DAI), every 7 days and for a period of 28 days, the severity of the symptoms caused by the bacteria was visually evaluated. In another group of plants of the same cultivars and inoculated in the same way, the activity of defense enzymes guaiacol peroxidase (POX), catalase (CAT), polyphenoloxidase (PFO), lipoxygenase (LPOX) and phenylalanine ammonia lyase (FAL), the content of phenolic and flavonoid compounds, the number of stomata showing a hypersensitivity reaction (HR), the number of cells showing callose accumulation, and the levels of chlorophyll a, b and carotenoids. Plants of the most susceptible cultivar, All Big, had higher POX and PFO enzyme activities, higher callose accumulation and higher contents of chlorophyll a. At the same time, an increase in the activity of the CAT enzyme in the Yolo Wonder cultivar and of the LPOX enzyme in the Amarelo SF cultivar was observed, in the latter the highest number of cells with hypersensitivity reaction was also found. It was also observed that the All Big cultivar plants had a higher chlorophyll than the Amarelo SF and Yolo Wonder plants. However, no significant differences were observed in carotenoid content in plants of different cultivars. On the other hand, to evaluate the protective effect and mode of action of cell suspensions of Saccharomyces cerevisiae in controlling this disease, sweet pepper plants of the Rubi Gigante cultivar were sprayed with a suspension of S. cerevisiae (8 x 107 cells mL-1) 3 days after being challenged with X. euvesicatoria pv. euvesicatoria (0.6 AU at 600 nm). As a negative control, the plants were sprayed with distilled water and as a positive control, they were sprayed with the inducer Bion® (acibenzolar-S-methyl - ASM) at 50 ppm of the active ingredient. The severity of the bacterial spot was evaluated, as well as the activity of defense enzymes POX, CAT, PFO, FAL, and the content of chlorophyll a, b and carotenoids. Subsequently, this experiment was repeated and conducted in the same way, but using the All Big cultivar, which is more susceptible than Rubi Gigante. In this experiment, the suspension of S. cerevisiae reduced the severity of the bacterial spot by up to 20% and activated the catalase enzyme (CAT) in the Rubi Gigante cultivar, while in the All Big cultivar it reduced it by up to 35%, and activated the peroxidase enzymes (POX) and polyphenol oxidase (PFO). ASM, on the other hand, reduced the disease by up to 40% in the Rubi Gigante cultivar and by up to 85% in the All Big cultivar, and activated the enzymes phenylalanine ammonia-lyase (FAL), POX and PFO only in Rubi Gigante. Finally, the effect of two aloe vera polysaccharide fractions on the reduction of bacterial spot was evaluated, a white fraction (Bab FB) and a pink one (Bab FR), both obtained through ethanolic precipitation of aloe leaf gel. Firstly, sweet pepper plants cv. Rubi Gigante were sprayed with Bab FB at 0.5, 1.5 and 3 mg/mL, autoclaved at 120°C for 20 minutes, and applied to the plants 3 days before inoculation (DAi) with X. euvesicatoria pv. euvesicatoria. Subsequently, in order to find out which way of preparing the fractions is more efficient to reduce the symptoms of the disease, both fractions were submitted to different temperatures and heating times (30 min at 100°C, 20 min at 120°C or 30 min at 60°C) and applied 3 days before inoculation. Finally, the influence of the application interval of Bab FB and Bab FR at 3 mg/mL (heated for 30 minutes at 100°C), applied 3 or 7 days before inoculation, and compared with the ASM inducer at 50 ppm was verified. First, it was observed that Bab FB at 0.5, 1.5 and 3 mg/mL and heated at 120°C for 30 minutes did not reduce disease severity. After, Bab FB and Bab FR, both at 3 mg/mL and heated for 30 minutes at 100°C, reduced disease severity at 28 and 21 days after inoculation (DAI). However, in the following experiment when Bab FB and Bab FR, both at 3 mg/mL, were heated to 100°C for 30 minutes and applied 3 or 7 days before inoculation, they did not significantly reduce the severity of bacterial spot symptoms. On the contrary, ASM has always significantly reduced disease severity. With the results of the present study it is concluded that the activity of CAT, LPOX and the accumulation of cells with hypersensitivity reaction are involved in the innate resistance of pepper to X. euvesicatoria pv. euvesicatoria. On the other hand, it is concluded that the yeast S. cerevisiae and ASM have the potential to help manage the disease.