Biossíntese de ácido propiônico e análise do comportamento de Salmonella Typhimurium ATCC 14028 exposta a ácidos orgânicos

Abstract

A utilização excessiva de antibióticos promotores de crescimento na cadeia produtiva avícola tem sido uma preocupação em relação ao desenvolvimento de bactérias resistentes. Os ácidos orgânicos (AO) de base petroquímica são amplamente utilizados na indústria avícola em substituição aos antibióticos, mas sua produção não é sustentável, pois dependem de fontes finitas e causam poluição ambiental durante o processo. Uma alternativa sustentável são os AO microbianos, que podem minimizar o impacto ambiental e garantir a segurança dessa importante cadeia mundial de produção de alimentos. Nesse contexto, o objetivo geral desse estudo foi testar o efeito de AO (petroquímicos e produzidos por via microbiana) em diferentes pHs (4,5, 5,5 e 5,5) e condições de oxigênio, além de modelar a cinética de crescimento e inativação de Salmonella Typhimurium, que é um dos patógenos mais pertinentes no setor avícola. Os compostos avaliados para inibir S. Typhimurium incluem ácido propiônico (AP) e acético (AA) de origem petroquímica, mistura de AO do caldo da fermentação propiônica, propionic fermentation broth, (PFB) produzida por Propionibacterium freudenreichii e dois produtos comerciais com misturas de AO. Todos os experimentos foram realizados em meio BHI ajustado para os pH desejados com HCl 1 M, assim como os AO do PFB para obtenção de soluções de PFB em cada pH. As concentrações de PFB analisadas foram calculadas com base na concentração de AP presente no caldo. Todos os testes foram incubados a 37?°C por 48 h sem agitação e a contagem dos sobreviventes foi realizada em tempos pré-determinados. Determinou-se concentrações inibitórias mínimas (CIM) e concentrações bactericidas mínimas (CBM) dos compostos, como a menor concentração capaz de inibir o crescimento, e de reduzir 3-log de S. Typhimurium em 48 h de contato, respectivamente. Reailzou-se modelagem matemática para avaliar o efeito das concentrações dos ácidos sobre os parâmetros dos modelos primários e estimar concentrações do AP e do PFB para reduzir 3-log de S. Typhimurium em 3 h (tempo de trânsito intestinal de frangos) por modelagem secundária. Os resultados mostraram que a melhor condição para inativação de S. Typhimurium em contato com o AP foi em pH 4,5, com CIM de 7 mM e CBM de 10 mM. Em condições de oxigênio limitado, não foi possível determinar a CIM do AA em pH 4,5. No entanto, em aerobiose, a CIM do AA para S. Typhimurium foi de 4 mM. Em pH 5,5, a eficiência do AA aumentou em cerca de 3 vezes em condições de oxigênio limitado. Para inibição da cepa pelo PFB, a melhor condição observada foi em pH 4,5, com CIM de 3,5 mM e CBM de 10 mM. As concentrações de AP e PFB em pH 4,5 estimadas por extrapolação do modelo secundário exponencial para reduzir 3-log de S. Typhimurium em 3 h foram 94 e 46,4 mM, respectivamente. Embora o modelo tenha sido preciso na previsão da concentração de AP, no PFB, as 3 reduções decimais do patógeno só foram obtidas após 10 h de contato. A combinação do AP e AA no PFB teve efeito sinérgico apenas em pH 4,5, com índices de concentração inibitória fracionada (FICindex) menor que 1. Por fim, as reduções logarítmicas de S. Typhimurium em contato com o PFB em pH 4,5 e 5,5 foram tão eficientes quanto às obtidas pelos produtos de AO comerciais testados, demonstrando que o PFB pode ser uma solução alternativa promissora para substituição de AO de base petroquímica, sendo um antimicrobiano natural com grande potencial de uso em indústrias avícolas para o controle de S. Typhimurium.

Abstract: The excessive use of antibiotics growth promoting in the poultry production chain has been a concern regarding the development of antibiotic-resistant bacteria. Petrochemical-based organic acids (OA) are widely used in the poultry industry as a replacement for antibiotics, but their production is not sustainable because they depend on finite sources and cause environmental pollution during the process. A sustainable alternative is microbial OA, which can minimize environmental impact and ensure the safety of this important worldwide food production chain. In this context, the general objective of this study was to test the effect of OA (petrochemical produced via microbial fermentation) at different pHs (4.5, 5.5, and 5.5) and oxygen conditions, as well as to model the growth and inactivation kinetics of Salmonella Typhimurium, which is one of the most pertinent pathogens in the poultry sector. The compounds evaluated to inhibit S. Typhimurium included propionic acid (PA) and acetic acid (AA) derived from petrochemical sources, a mixture of OA from propionic fermentation broth (PFB) produced by Propionibacterium freudenreichii, and two commercial products with OA mixtures. All experiments were carried out in BHI medium adjusted to the desired pH with 1 M HCl, as well as the PFB OAs to obtain PFB solutions at each pH. The PFB concentrations analyzed were calculated based on the concentration of PA present in the broth. All tests were incubated at 37 °C for 48 h without shaking, and survivors were counted at predetermined times. Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MIC) of the compounds were determined as the lowest concentration able to inhibit growth, and to reduce 3-log of S. Typhimurium in 48 h of contact, respectively. Mathematical modeling was performed to evaluate the effect of acid concentrations on the parameters of the primary models, and to estimate AP and PFB concentrations to reduce 3-log S. Typhimurium in 3 h (chicken intestinal transit time) by secondary modeling. The results showed that the best condition for the inactivation of S. Typhimurium in contact with PA was at pH 4.5, with a MIC of 7 mM and MBC of 10 mM. Under limited oxygen conditions, it was not possible to determine the MIC of AA at pH 4.5. However, under aerobic conditions, the MIC of AA for S. Typhimurium was 4 mM. At pH 5.5, the efficiency of AA increased about three times under limited oxygen conditions. For inhibition of the strain by PFB, the best condition observed was at pH 4.5, with a MIC of 3.5 mM and MBC of 10 mM. The AP and PFB concentrations estimated by extrapolation of the exponential secondary model to reduce 3 logs of S. Typhimurium in 3 h at pH 4.5 were 94 and 46.4 mM, respectively. Although the model was accurate in predicting the AP concentration, in PFB, the 3 decimal reductions of the pathogen were only obtained after 10 hours of contact. The combination of PA and AA in PFB had a synergistic effect only at pH 4.5, with fractional inhibitory concentration (FICindex) less than 1. Finally, the logarithmic reductions of S. Typhimurium in contact with PFB at pH 4.5 and 5.5 were higher than those obtained by the tested commercial AO products. This demonstrates that PFB can be a promising alternative solution to substitute AO from a petrochemical base, being a natural antimicrobial with great potential for use in the poultry industry for the control of S. Typhimurium.