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Abstract:
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O câncer de pulmão está entre os mais comuns e letais em todo o mundo e, entre as mutações
que caracterizam essa doença, cerca de 30% dos pacientes apresentam mutações e
amplificações em genes da via do fator de transcrição NRF2 (gene
NFE2L2
) (
Nuclear
factor
(erythroid
-
derived 2)
-
like 2
) ou seu inibidor KEAP1 (
Kelch
-
like
-
ECH associated protein 1
). O
NRF2 confere um fenótipo de resistência à agentes alquilantes e compostos de platina por esses
tumores, e uma sobrevida menor dos pacientes com esse subtipo
tumoral. Essa proteção
tumoral mediada por NRF2 é dependente de enzimas de síntese de GSH (glutationa), TXNRD1
(tioredoxina redutase 1) e dentre outros, componentes que possuem papel na homeostase redox
e/ou detoxificação de xenobióticos. Para o seu estud
o e de suas vias, utilizam
-
se inibidores de
NRF2, porém o seu tempo de inibição é restrito e a consequência de sua ação também pode
demorar para acontecer, por não eliminar o NRF2 que foi sintetizado anteriormente ao
silenciamento. Assim, o uso de técnicas
para “
knockout
” ou deleção de NRF2, como o
CRISPR/Cas9, podem ser úteis para o estudo dos fenótipos tumorais associados a mutações
nesta via. Dessa forma, o objetivo deste projeto de pesquisa foi a validação de protocolo para
knockout
de
NFE2L2,
utilizand
o sistema CRISPR/Cas9, em linhagem de câncer de pulmão de
células não
-
pequenas, A549, de modo a reduzir a ativação dessa via. Nos clones celulares
geneticamente modificados, serão avaliados os fenótipos de proliferação e migração celular, a
sua resistência
a diversos quimioterápicos de uso clínico e potenciais terapias alvo baseadas
em sistema redox, em relação à linhagem A549 mutante para a via NRF2. No projeto foi
utilizado o plasmídeo PX458 (Addgene), que já contém a Cas9 em sua estrutura. Até então o
pr
otocolo está parcialmente estabelecido: a digestão do plasmídeo com a enzima BbsI
(Thermo), por meio de eletroforese, e sua purificação usando o kit QIAquick Gel Extraction
Kit (QIAGEN), pela quantificação de DNA no equipamento NanoDrop, foram confirmadas.
A
etapa de transformação das bactérias, feita com base no protocolo do fabricante, foi efetiva,
com crescimento bacteriano nas placas com o plasmídeo clonado com o guia e adição do
antibiótico Ampicilina, o que evidencia que o gene de resistência à ampici
lina do plasmídeo
está sendo expresso pela bactéria e, portanto, que o plasmídeo está funcional. Para confirmação
da inserção do guia no plasmídeo o PCR de colônia foi realizado, utilizando
-
se um
primer
forward
específico para o plasmídeo PX458 e o próprio
gRNA
reverse
como
primer
reverse
da reação. Vimos a presença do guia em todas as colônias, já que houve amplificação do gRNA
reverse
, marcada com a banda na região de 100pb. Contudo, ainda não se tem certeza de que o
gRNA
forward
foi inserido, por isso pr
osseguiremos ao sequenciamento, a fim de confirmar
que os dois guias estão inseridos no plasmídeo. |
