Mecanismos de citotoxicidade induzidos pelo fungicida Mancozeb em células de neuroblastoma humano

Abstract

A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais prevalente do sistema nervoso central (SNC). É caracterizada pela morte de neurônios dopaminérgicos na substância negra compacta, culminando em depleção de dopamina no estriado e diminuição das funções motoras. Sua fisiopatologia envolve estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e neuroinflamação. Apesar do envelhecimento ser o principal fator de risco para desenvolver a DP, diversos estudos vêm mostrando uma relação entre exposição ocupacional à agrotóxicos com o aumento no risco de desenvolvimento da DP idiopática. O Mancozeb (MZ) é um agrotóxico pertencente a classe dos etilenobisditiocarbamatos (EBDCs), amplamente utilizado no país devido ao seu grande potencial fungicida e sua baixa toxicidade aguda. Estudos sugerem que o uso de agrotóxicos EBDCs na agricultura poderia contribuir para o desenvolvimento da DP. Entretanto, ainda não existem evidências que suportem esta associação e, apesar da extensa utilização mundial de MZ, existe um número limitado de estudos investigando o efeito neurotóxico do fungicida. O objetivo desse estudo foi avaliar a citotoxicidade induzida pelo fungicida MZ, em culturas de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y, que possuem características de neurônios dopaminérgicos, e avaliar alterações celulares relacionadas a DP. As células foram expostas ao MZ (1 ? 30 µM) e foram realizados ensaios de viabilidade e morte celular em diferentes tempos de exposição. Além disso, foram avaliados outros parâmetros como a geração de espécies reativas (ER), produção de radical ânion superóxido (O2?-), concentração de glutationa (GSH), peroxidação lipídica, potencial de membrana mitocondrial (PMM), níveis de citocinas inflamatórias (IL-1ß, IL-6 e TNF-a) e avaliação de dano ao DNA. A exposição ao MZ, durante 24 horas, induziu diminuição na viabilidade celular, a partir da concentração de 6 µM e induziu morte celular significativa a partir de 15 µM. Esses efeitos citotóxicos do fungicida foram dependentes tanto do tempo de exposição quanto da concentração. Além disso, o MZ (6 µM) induziu aumento significativo na geração de ER após 1 hora de exposição e aumentou a produção de O2?- após 1 e 3 horas de exposição. Foi também observado um aumento significativo na geração de hidroperóxidos lipídicos (marcador de peroxidação lipídica) e diminuição no conteúdo intracelular de GSH após 3 horas de exposição ao MZ. O tratamento com o antioxidante ácido ascórbico (50 µM) foi capaz de proteger as células do dano causado pelo MZ, sugerindo que um dos principais mecanismo de citotoxicidade envolvidos na perda de viabilidade das células parece ser o estresse oxidativo. A exposição ao MZ também causou diminuição do PMM após 3 horas de exposição, sugerindo um possível envolvimento da disfunção mitocondrial no mecanismo de toxicidade do agrotóxico. Em relação às citocinas, não houve detecção após a exposição ao MZ. Por fim, o MZ (6 µM) induziu dano ao DNA após 24 horas de exposição, sugerindo um efeito genotóxico do fungicida. Os resultados do estudo indicam que a exposição ao MZ induz distúrbios celulares compatíveis com eventos observados na DP, sugerindo uma possível relação entre a exposição ao agrotóxico e o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas como o Parkinson. Entretanto, esses resultados in vitro são preliminares e mais estudos são necessários para melhor estabelecer essa relação, bem como, para elucidar outros mecanismos celulares envolvidos na citotoxicidade do fungicida.

Abstract: Parkinson's disease (PD) is the second most prevalent neurodegenerative disorder of the central nervous system (CNS). It is characterized by the death of dopaminergic neurons in the substantia nigra compacta, culminating in dopamine depletion in the striatum and decreased motor function. Its pathophysiology involves oxidative stress, mitochondrial dysfunction and neuroinflammation. Despite aging being the main risk factor for developing PD, several studies have shown a relationship between occupational exposure to pesticides and an increased risk of developing idiopathic PD. Mancozeb (MZ) is a pesticide belonging to the class of ethylenebisdithiocarbamates (EBDCs), widely used in the country due to its great fungicidal potential and its low acute toxicity. Studies suggest that the use of EBDC pesticides in agriculture could contribute to the development of PD. However, there is still no evidence to support this association and, despite the extensive worldwide use of MZ, there is a limited number of studies investigating the neurotoxic effect of the fungicide. The aim of this study was to evaluate the citotoxicity induced by the fungicide MZ, in cultures of SH-SY5Y human neuroblastoma cells, which have characteristics of dopaminergic neurons, and to evaluate cellular alterations related to PD. Cells were exposed to MZ (1 ? 30 µM) and viability and cell death assays were performed at different exposure times. In addition, other parameters were evaluated, such as the generation of reactive species (RE), production of superoxide anion radical (O2?-), concentration of glutathione (GSH), lipid peroxidation, mitochondrial membrane potential (PMM), levels of inflammatory cytokines (IL-1ß, IL-6 and TNF-a) and evaluation of DNA damage. Exposure to MZ, for 24 hours, induced a decrease in cell viability, starting from a concentration of 6 µM and induced significant cell death from 15 µM. These cytotoxic effects of the fungicide were dependent on both exposure time and concentration. Furthermore, MZ (6 µM) induced a significant increase in ER generation after 1 hour of exposure and increased O2?- production after 1 and 3 hours of exposure. A significant increase in the generation of lipid hydroperoxides (a marker of lipid peroxidation) and a decrease in the intracellular GSH content after 3 hours of exposure to MZ was also observed. Treatment with the antioxidant ascorbic acid (50 µM) was able to protect cells from damage caused by MZ, suggesting that one of the main cytotoxicity mechanisms involved in the loss of cell viability seems to be oxidative stress. Exposure to MZ also caused a decrease in PMM after 3 hours of exposure, suggesting the possible involvement of mitochondrial dysfunction in the pesticide toxicity mechanism. Regarding cytokines, there was no detection after exposure to MZ. Finally, MZ (6 µM) induced DNA damage after 24 hours of exposure, suggesting a genotoxic effect of the fungicide. The results of the study indicate that exposure to MZ induces cellular disorders compatible with events observed in PD, suggesting a possible relationship between exposure to pesticides and the development of neurodegenerative diseases such as Parkinson's. However, these in vitro results are preliminary and further studies are needed to better establish this relationship, as well as to elucidate other cellular mechanisms involved in the cytotoxicity of the fungicide.