Uso de solvente eutético profundo natural como fase extratora associada à microextração líquido-líquido de membrana microporosa de fibra oca para determinação de biomarcadores de câncer de pulmão em urina

Abstract

Hexanal e heptanal são considerados biomarcadores de câncer de pulmão que podem ser encontrados em diferentes matrizes biológicas, tais como sangue e urina. Eles têm sua determinação em HPLC-DAD dificultada devido a sua volatilidade, baixa absorção na região UV, complexidade da matriz e as baixas concentrações em que são encontrados nas amostras. Neste trabalho desenvolveu uma metodologia para a determinação de hexanal e heptanal analitos em urina utilizando solventes eutéticos profundos naturais como fase extratora para microextração líquido-líquido de membrana microporosa de fibra oca (HF-MMLLE) acoplada a um sistema de placas de 96 poços de amostragem. A membrana de polipropileno (PP) foi utilizada com 1 cm de comprimento submetida a impregnação em 300 µL de DES seguida pelo processo de extração em 1,5 mL de amostra de urina. Os experimentos foram realizados acoplando a técnica de HF-MMLLE ao sistema de placas de 96 poços de amostragem que permite a realização de até 96 extrações simultâneas. As otimizações de parâmetros importantes para extração e dessorção foram realizadas através de planejamentos uni e multivariados. O solvente extrator que apresentou melhores respostas foi a mistura eutética de ácido dodecanóico e ácido hexanóico (1:3). O estudo do modo de derivatização apresentou melhores eficiências de extração quando a reação de derivatização foi realizada após o processo de extração. O solvente de dessorção otimizado foi uma mistura de 50% metanol e 50% acetonitrila (v/v), sendo que o tempo de dessorção ótimo foi de 5 minutos. Um planejamento fatorial completo mostrou que apenas o tempo de derivatização não foi significativo para o processo de extração e então este foi fixado em 30 minutos, já para o tempo de extração, pH e quantidade de derivatizante foi realizado um estudo através de um planejamento box behnken que mostrou melhores resultados quando o pH da amostra foi mantido em 6, a quantidade de derivatizante em proporção 1:30 (aldeído:derivatizante) e extrações de 60 minutos. Os parâmetros analíticos de mérito para a metodologia foram determinados avaliando uma faixa linear de 100 a 800 (ng mL?1), apresentando coeficientes de determinação (R²) de 0,9973 para o hexanal e 0,9935 para o heptanal. Os LODs obtidos foram de 0,3 e 0,26 nmol mL ?1 para hexanal e heptanal respectivamente, e os LOQs de 1,00 nmol mL ?1 para hexanal e 0,87 nmol mL ?1 para heptanal, valores adequados para auxílio no diagnóstico de câncer de pulmão. Ensaios de precisão intradia e interdia foram realizados nas concentrações de 100, 400 e 800 ng mL?1 que variaram de 9 a 20% e de 17 a 20%, respectivamente. A exatidão do método foi avaliada pela recuperação relativa em concentrações de 100 e 500 ng mL?1 e apresentou resultados variando de 55,2 a 97,3%. A metodologia foi aplicada em amostras de urina de 3 voluntários nas quais as respostas apresentaram abaixo do limite de detecção do método. O estudo realizado neste trabalho é pioneiro na utilização de solventes eutéticos profundos naturais (NADES) como solvente extrator para técnica de HF-MMLLE na determinação de hexanal e heptanal em urina humana, mostrando vantagens relacionadas a alta frequência analítica do método proporcionada pelo tempo de preparo de amostra de 1,09 minutos por amostra, aliado a substituição de solventes orgânicos normalmente utilizados na técnica por um solvente verde atendendo a parâmetros da química analítica verde.

Abstract: Hexanal and heptanal are considered lung cancer biomarkers that can be found in different biological matrices, such as blood and urine. Their analysis is difficult due to their volatility, low absorption in the UV region, complexity of the matrix and the low concentrations at which they are found in the samples. This work developed a methodology for the determination of hexanal and heptanal in urine using natural deep eutectic solvents as an extractor phase for liquid-liquid microextraction of hollow fiber microporous membrane (HF-MMLLE) coupled to a 96-well system. A 1 cm polypropylene (PP) membrane was used, subjected to impregnation in 300 µL of DES followed by the extraction process in 1.5 mL of urine sample. The experiments were carried out coupling the HF-MMLLE technique to the 96-well plate systemthat allows the simultaneous extraction of up to 96 samples. Optimizations of important parameters for extraction and desorption were carried out through univariate and multivariate designs. The extractor solvent that showed the best responses was the eutectic mixture of dodecanoic acid and hexanoic acid (1:3). For the derivatization mode it was selected as optimum condition the derivatization performed after the extraction process. The optimized desorption solvent was a mixture of 50% methanol and 50% acetonitrile (v/v), and the optimal desorption time was 5 minutes. A full factorial design showed that only the derivatization time was not significant for the extraction process and so this was fixed at 30 minutes, as for the extraction time, pH and amount of derivatizer, a study was carried out through a box behnken planning which showed better results when the pH of the sample was maintained at 6, the amount of derivatizing agent in a proportion of 1:30 (aldehyde:derivatizing) and extractions of 60 minutes. The analytical parameters of merit for the methodology were determined by evaluating a linear range from 100 to 800 ng mL?1, with coefficients of determination (R²) of 0.9973 for hexanal and 0.9935 for heptanal. The LODs obtained were 0.3 and 0.26 nmol mL -1 for hexanal and heptanal respectively, and the LOQs of 1.00 nmol mL-1 for hexanal and 0.87 nmol mL -1 for heptanal, adequate values to aid in the diagnosis of cancer lung. Intraday and interday precision tests were performed at concentrations of 100, 400 and 800 ng mL?1, which ranged from 9 to 20% and from 17 to 20%, respectively. The accuracy of the method was evaluated by the relative recovery at concentrations of 100 and 500 ng mL?1, with results ranging from 55.2 to 97.3%. The methodology was applied to urine samples from 3 volunteers in which none of the analytes were detected. The study carried out in this work is a pioneer in the use of natural deep eutectic solvents (NADES) as extractor solvent for the HF-MMLLE technique in the determination of hexanal and heptanal in human urine, showing advantages related to the high analytical frequency of the method provided by the sample preparation time of 1.09 minutes per sample, combined with the replacement of organic solvents normally used in the technique by a green solvent, meeting the parameters of green analytical chemistry.