Mudanças funcionais da ilhota pancreática de camundongos em diferentes estágios do desenvolvimento como guia para melhorar a maturação das células do tipo beta originadas a partir de células-tronco humanas pluripotentes

Abstract

O diabetes mellitus (DM) é uma síndrome de etiologia múltipla caracterizada por hiperglicemia crônica. Independente da etiologia, o DM reduz o número de células ß e, qualquer forma de DM seria beneficiada com um tratamento que promova a regeneração de células ß. Uma técnica promissora é o desenvolvimento de células ß a partir de células-tronco humanas pluripotentes (hPSC), denominadas hPSC-ß. O que limita essa técnica é a geração de hPSC-ß viáveis para o transplante em humanos, pois elas não chegam em um estágio de maturação suficiente para secretar insulina, e consequentemente, não podem ser utilizadas na remissão do DM. Para desenvolver metodologias que culminem na maturação das HPSC-ß é necessário compreender como a maturação acontece em células ß pancreáticas durante o desenvolvimento e conhecer quais os elementos e os fatores internos e externos envolvidos. Acredita-se que a capacidade secretória de insulina estimulada pela glicose seja alcançada devido às alterações em fatores de transcrição, nas vias AMPK e mTORC, na atividade mitocondrial e na maquinaria de processamento e exocitose da insulina durante a maturação. Dessa forma, investigamos as alterações funcionais, transcricionais e metabólicas que ocorrem durante a maturação das células ß pancreáticas de camundongos C57 nos estágios neonatos 3, 9 e 20 dias após o nascimento e adultos (45-60 dias). Depois do isolamento das ilhotas nos períodos já citados, incubamos as ilhotas em meio RPMI por 24h e depois analisamos a expressão gênica, proteica e realizamos a secreção de insulina estimulada pela glicose (GSIS). Os dados foram analisados no software Graph Prism 8. Observamos maior expressão de mRNA de MAFA, PAX6, INS, GLUT2, GCK que são importantes para identidade, maturação e função de células ß pancreática em ilhotas de adultos (ilhota madura), como também vimos que maior expressão de ERO1 ao decorrer da maturação e expressão elevada da PDIA6 durante todo o desenvolvimento. Esses dois últimos genes codificam proteínas abundantes do retículo endoplasmático (RE). Verificamos que a proliferação é maior em ilhotas de neonatos (ilhotas imaturas), com a expressão do Ki67. A GSIS foi maior em células ß maduras, demonstrando uma maior eficiência na secreção de insulina. Porém, encontramos maior secreção de insulina em ilhotas imaturas em relação ao conteúdo total e mesmo tendo uma secreção basal aumentada, para uma secreção de 50% do conteúdo total, essas precisam de um estímulo maior de glicose. Dessa forma concluímos que os fatores de transcrição importantes na identidade e para a maturidade da célula ß pancreática são aumentados a partir do 9º dia após o nascimento, mas diferente disso, a GSIS eficiente é alcançada somente após o 20º dia após o nascimento.

Abstract: Diabetes Mellitus (DM) is a multiple etiology metabolic syndrome characterized by Chronic hyperglycemia. Regardless of its etiology, DM reduces pancreatic ß cell numbers, and any type of DM would benefit from a treatment that promotes ß cell regeneration. (So, any treatment that promotes ß cell regeneration would benefit every type of DM.) One promising technique is the development of ß cell derived from human pluripotent steam cells (hPSC) described as hPSC- ß. The limiting factor on this approach, is the viable generation of hPCS- ß necessary for human transplantation, due to the inability on reaching a maturation state enough in order to secrete insulin, and so, being unable to reverse the DM state. In order to develop strategies that reach hPSC- ß maturation, the comprehension of how the maturation process occurs throughout its development and point which elements and all possible factors involved. It is to believe that glucose stimulated insulin secretion capacity would be achieved due to alterations in transcription factors, AMPK and mTOR pathways, mitochondrial activity and in the insulin processing machinery and its exocytosis during maturation. Thus, we investigate functional, transcriptional and metabolic alterations throughout pancreatic ß cell maturation of C57 mice, during newborn stages P3, P9, and P20 and adults (45-60 days). After isolation, islets were incubated in RPMI medium for 24 hours, and then we analyzed genetic and proteic expression and glucose stimulated insulin secretion (GSIS). Data was analyzed with the GraphPad Prism 8. We observed an increased mRNA expression of MAFA, PAX6, INS, GLUT2 and GCK, these being crucial to identity, maturation and ß cell function, and also, it was showed increased ERO1 expression in mature ß cells and increased PDIA6 expression as well. These last cited genes are responsible for coding proteins abundantly in the endoplasmic reticulum (RE). Data showed that proliferation was increased in immature cells through Ki67 expression, and GSIS was increased in mature ß cells, attesting an efficiency in insulin secretion. Therefore, our research presented a higher insulin secretion on immature ß cells in relation to the total content, even showing an increased baseline secretion. In order to secret about 50% of it?s total content, immature cells need an increased glucose stimuli. In conclusion, our data showed that transcription factors essential for ß cell identity and its maturation are increased from the 9° day after birth, but other than that, an efficient GSIS is only achieved from the 20° day after birth.