Produção, purificação, caracterização e insights estruturais de cutinases do ascomiceto Fusarium verticillioides: de sistemas convencionais de produção via fermentação em estado sólido à expressão heteróloga em Escherichia coli

Abstract

As cutinases são serina esterases pertencentes à superfamília das a/ß hidrolases. Os substratos naturais dessas enzimas são cutina e suberina, componentes da cutícula vegetal. Alguns fungos filamentosos produzem cutinases como estratégia para facilitar a infecção de plantas. Os primeiros relatos da detecção de cutinases ocorreram na década de 1960 e estavam relacionados a características de patogenicidade e virulência de alguns fungos produtores dessa enzima. O aumento no interesse por cutinases tem ocorrido principalmente devido ao seu potencial para hidrólise de plásticos. No entanto, essas enzimas são capazes de hidrolisar diversos outros substratos, como cutículas de plantas, para obtenção de produtos com valor agregado. As cutinases de Fusarium verticillioides são pouco exploradas na literatura. Nesse sentido, o presente estudo tem por objetivo explorar as cutinases produzidas pelo ascomiceto F. verticillioides, Para tanto foi avaliada a produção de cutinase pelo microrganismo selvagem via fermentação em estado sólido (FES) e a produção via expressão heteróloga. A produção via FES foi otimizada. A composição do meio foi uma das variáveis avaliadas, com o objetivo de aumentar a porosidade do substrato sólido. Após otimização e avaliação dos parâmetros espessura do meio e tempo de fermentação a atividade de cutinase aumentou aproximadamente 10 vezes. A atividade chegou a 9,14 U/gsubstrato para uma espessura de substrato de 4 cm e 12 dias de fermentação. Na etapa de scale up, a produção de cutinase em reator com agitação mecânica não obteve sucesso. A maior atividade para 7 dias de fermentação foi 0,4 U/gsubstrato. A produção em reator de leito fixo foi razoavelmente superior (1,3 U/gsubstrato em 7 dias). As baixas atividades obtidas no scale up podem ser atribuídas a condições ambientais e ao menor tempo de fermentação avaliado, em comparação com a atividade em frascos menores. Diante das limitações de produção da enzima pelo microrganismo selvagem utilizando FES, as cutinases de F. verticillioides foram produzidas por expressão heteróloga e caracterizadas individualmente quanto a função e estrutura. As três sequências codificadoras de cutinases (CDS) foram clonadas, produzidas em Escherichia coli e purificadas por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). FvCut1 apresenta diferenças estruturais e funcionais mais evidentes. FvCut1, FvCut2 e FvCut3 apresentaram temperaturas ótimas de 20, 40 e 35 °C e pH ótimo de 9, 7 e 8, respectivamente. Alguns produtos químicos foram capazes de melhorar a atividade enzimática, como CaCl2 e fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF) no caso de FvCut1 e Triton X-100 para FvCut2 e FvCut3, enquanto o KCl mostrou o mesmo efeito para FvCut3. Os parâmetros cinéticos revelaram que FvCut1 possui maior eficiência enzimática no substrato pnitrofenilbutirato (p-NPB) em comparação com FvCut2 e FvCut3. A estrutura tridimensional dessas enzimas revela que as três cutinases possuem um sítio catalítico do tipo fenda rasa exposta ao solvente, típico de cutinases. FvCut1 possui um sítio catalítico mais fechado. Essa abertura de fenda pequena pode resultar em dificuldade para hidrolisar substratos volumosos, como polietileno tereftalato (PET). Portanto, FvCut1, FvCut2 e FvCut3 foram avaliadas quanto a capacidade de hidrolisar PET e não foi possível detectar produtos de hidrólise nas amostras avaliadas. Um indício de que essas cutinases apresentam dificuldade para hidrolisar esse tipo de polímero. Essa foi a primeira vez que se avaliou o scale-up da produção de cutinases de F. verticillioides via FES e, também, a primeira vez que três cutinases desse fungo foram expressas em sistema procarioto e caracterizadas funcional e estruturalmente. Os resultados do presente estudo fornecem insights que podem orientar a produção de cutinases de F. verticillioides e influenciar futuras decisões referentes a aplicações dessas enzimas, além de contribuir para a ampliação do conhecimento da diversisdade de cutinases.

Abstract: Cutinases are serine esterases belonging to the a/ß hydrolases superfamily. The natural substrates of these enzymes are cutin and suberin, components of the plant cuticle. Some filamentous fungi produce cutinases as a strategy to facilitate plant infection. The first reports of the detection of cutinases occurred in the 1960s and were related to the pathogenicity and virulence characteristics of some fungi that produce this enzyme. The increased interest in cutinases has been mainly due to their potential for the hydrolysis of plastics. However, these enzymes can hydrolyze several other substrates, plant cuticles to obtain products with added value. Fusarium verticillioides cutinases are little explored in the literature. In this sense, the present study aims to explore the cutinases produced by the ascomycete F. verticillioides, contributing to increasing knowledge about the diversity of cutinases. For this purpose, cutinase production by the wild microorganism via solid-state fermentation (FES) and production via heterologous expression were evaluated. Production via FES has been optimized. The composition of the medium was one of the evaluated variables, with the aim of increasing the porosity of the solid substrate. After optimization and evaluation of the parameters of medium thickness and fermentation time, the cutinase activity increased approximately 10 times. The activity reached 9.14 U/gsubstrate for a substrate thickness of 4 cm and 12 days of fermentation. In the scale-up stage, the production of cutinase in a reactor with mechanical agitation was unsuccessful. The highest activity for 7 days of fermentation was 0.4 U/gsubstrate. Production in a fixed bed reactor was reasonably higher (1.3 U/gsubstrate in 7 days). The low activities obtained in the scale-up can be attributed to environmental conditions and the shorter fermentation time evaluated, in comparison with the activity in smaller flasks. Given the limitations of enzyme production by the wild microorganism using FES, cutinases from F. verticillioides were produced by heterologous expression and individually characterized in terms of functionality and structure. The three cutinases coding sequences (CDS) were cloned, produced in Escherichia coli and purified by size exclusion chromatography (SEC). FvCut1 presents more evident structural and functional differences. FvCut1, FvCut2 and FvCut3 showed optimum temperatures of 20, 40 and 35 °C and optimum pH of 9, 7 and 8, respectively. Some chemicals were able to improve enzyme activity, such as CaCl2 and phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) in the case of FvCut1 and Triton X-100 for FvCut2 and FvCut3, while KCl showed the same effect for FvCut3. Kinetic parameters revealed that FvCut1 has higher enzymatic efficiency on p-nitrophenylbutyrate (p-NPB) substrate than FvCut2 and FvCut3. The threedimensional structure of these enzymes reveals that the three cutinases have a shallow slit-type catalytic site exposed to the solvent, typical of cutinases. FvCut1 has a more closed catalytic site. This small slit opening can result in difficulty hydrolyzing bulky substrates such as polyethylene terephthalate (PET). Therefore, FvCut1, FvCut2 and FvCut3 were evaluated for their ability to hydrolyze PET and it was not possible to detect hydrolysis products in the evaluated samples. An indication that these cutinases have difficulty hydrolyzing this type of polymer. This was the first time that the scale-up of cutinase production by F. verticillioides was evaluated via FES, and the first time that three cutinases from this fungus were expressed in a prokaryotic system and functionally and structurally characterized. The results of the present study provide insights that can guide the production of cutinases by F. verticillioides and influence future decisions regarding the application of these enzymes, in addition to contributing to the expansion of knowledge of the diversity of cutinases.