Embriogênese somática de Guadua chacoensis (Bambusoideae; Poaceae): abordagens bioquímicas e morfoanatômicas

Abstract

Os bambus são plantas de múltiplos usos e apresentam importância social, econômica e ambiental. Entretanto, plantas deste grupo taxonômico são consideradas de difícil propagação e o uso de métodos biotecnológicos de cultivo in vitro se mostram essenciais para a propagação e conservação dos bambus. Dentre as rotas morfogenéticas in vitro, a embriogênese somática (ES) corresponde a menos compreendida e estudada até o momento, como protocolos descritos para apenas aproximadamente 30 espécies das mais de 1600 catalogadas. Para Guadua chacoensis, um bambu lignificado pertencente ao gênero de maior importância econômica das Américas, não existem protocolos de ES reportados. Assim, essa tese teve por objetivo descrever e caracterizar o processo de ES e de criopreservação de G. chacoensis utilizando abordagens morfoanatômicas e bioquímicas. Os resultados evidenciaram que o uso de explantes pré-tratados com estiolamento (mantidos no escuro), 400 uM de Picloram e originados da região basal resultaram em 87,5% de indução de calos e que as doses de Picloram utilizadas ao longo do processo de ES tem influência direta na geração das respostas, uma vez que a redução e remoção de Picloram permitiu a formação de culturas embriogênicas e maturação, respectivamente. Durante a fase de multiplicação, duas morfologias de culturas foram geradas: compactas e nodulares e friáveis e granulares, sendo as primeiras morfoanatomicamente caracterizadas como culturas embriogênicas (EC), por apresentarem células com citoplasma denso e embriões em estrutura globular e as segundas como culturas não embriogênicos (NEC), por apresentarem células alongadas, vacuoladas e sem formação de estruturas organizadas. Apenas as ECs foram capazes de maturar, entretanto, não foi alcançada a regeneração de plantas no presente trabalho. A caracterização bioquímica de EC e NEC revelou um aumento nos conteúdos de espermidina, arginina, metionina, maltose e manose em EC, sugerindo um possível envolvimento destas moléculas com a resposta embriogênica. A análise de proteômica comparativa de EC versus NEC permitiu a identificação de 855 proteínas, sendo 129 up- e 136 down-reguladas em EC. Os resultados sugerem o envolvimento de algumas classes de proteínas com a resposta embriogênica de G. chacoensis incluindo proteínas de resposta a estresse, de detoxicação, ribossomais e translacionais, do metabolismo de carboidratos, de formação de parede e de sinalização celular. EC apresentaram também aumentos na atividade de superóxido dismutase e guaiacol peroxidase, sugerindo que a ativação de mecanismos de defesa contra espécies reativas de oxigênio parece ser fundamental para a manutenção da homeostase celular e geração de resposta embriogênica. As EC se mostraram como uma boa fonte de materiais para o estabelecimento de suspensões celulares e, a partir destas, estabeleceu-se um protocolo de criopreservação, representando uma importante alternativa de conservação in vitro para esta espécie de bambu. Por fim, pode-se concluir que esta tese gerou resultados consistentes, descreveu e caracterizou um protocolo de ES e de criopreservação de G. chacoensis e explorou o envolvimento de poliaminas, aminoácidos, carboidratos, proteínas e enzimas antioxidantes com a resposta embriogênica, gerando importantes avanços para a cadeia produtiva e conservação de G. chacoensis.

Abstract: Bamboos are multiple-purpose plants that present social, economic, and environmental uses. However, they are considered plants of difficult propagation, and biotechnological approaches are essential for both the propagation and conservation of bamboo. Among the morphogenetic in vitro routes, somatic embryogenesis (SE) is considered the least understood and studied until now, presenting protocols for only approximately 30 species from more than 1600 already identified. For Guadua chacoensis, a lignified bamboo belonging to one of the genres of great importance in the Americas, to the best of our knowledge, no studies have been reported, emphasizing the importance of further studies. The present thesis aimed to describe and characterize the SE and cryopreservation of G. chacoensis through morphoanatomical and biochemical approaches. The results showed that the use of pre-treated etiolated explants (kept in the constant dark), 400 uM of Picloram, and basal region represents the best combination for callus induction, reaching 87,5% of induction. We observed that the use of different picloram concentrations directly influences SE-generated response, since the reduction and removal of picloram were necessary for embryo formation and maturation, respectively. During the multiplication phase, two cultures? morphology was observed: compact and nodular and friable and soft, whereas the first was morphoanatomically characterized as embryogenic culture (EC), since presents cells with dense cytoplasm and embryos in the globular stage, and the second was identified as non-embryogenic culture (NEC), showing elongated and vacuolated cells without the formation of any structure. Only EC was able to maturate, however, we did not achieve plant regeneration in the present study. Biochemical characterization of EC and NEC showed an increase in the content of spermidine, arginine, methionine, maltose, and mannose in EC, suggesting a possible involvement of these molecules with the embryogenic response. Comparative proteomic analysis of EC versus NEC identified 855 proteins, 129 up- and 136 down-regulated in EC. Moreover, our results imply that some classes of proteins seem to be associated with the embryogenic response of G. chacoensis, including proteins related to stress response, detoxication, ribosomal and translational process, carbohydrate metabolism, cell wall formation, and signaling transduction. EC presented an increase in the activity of superoxide dismutase and guaiacol peroxidases, suggesting that the activation of the defense response mechanism against reactive oxygen species seems to be essential for keeping cell homeostasis during the generation of an embryogenic response. Cell suspension culture was established by using EC as source material and was used for the establishment of a cryopreservation protocol, representing an important alternative for in vitro conservation of this bamboo specie. In summary, this thesis described and characterized SE and cryopreservation protocols and showed the involvement of polyamines, amino acids, carbohydrates, proteins, and antioxidant enzymes with the embryogenic response, generating important advances for the production chain and conservation of G. chacoensis.