Bioprospecção de bacteriófagos para biocontrole de Listeria spp. na indústria de alimentos

Abstract

A Listeria é um gênero que compreende bactérias com morfologia de bastonete, gram-positivas e anaeróbias facultativas. Esse gênero inclui diversas espécies, sendo a Listeria monocytogenes a mais estudada em função da sua patogenia. Listeria monocytogenes é um patógeno de origem alimentar que se destaca nas indústrias de alimentos dada sua alta resistência à salinidade e baixo pH, capacidade de crescimento em baixas temperaturas e habilidade de formar biofilmes. A sobrevivência e persistência deste patógeno em ambientes de processamento de alimentos estão diretamente relacionados com o aumento do risco de contaminação cruzada dos produtos alimentícios, potenciais mecanismos de resistência e a criação de microambientes protegidos que culminam na persistência de certas cepas. Diante dos desafios acerca de L. monocytogenes nas indústrias de alimentos aliado à crescente prevalência da resistência bacteriana aos antibióticos, novas abordagens biotecnológicas devem ser desenvolvidas e aprimoradas para controlar o crescimento microbiano. Neste contexto, os bacteriófagos surgem como uma alternativa útil e eficaz para o biocontrole bacteriano, visto sua atividade autorreguladora, baixa toxicidade para células eucarióticas e capacidade de lise do hospedeiro alvo. O presente trabalho teve como objetivo bioprospectar novos fagos e aplicá-los em superfícies visando o biocontrole de Listeria monocytogenes. Para tanto, foram feitas induções de infecções de bacteriófagos in vitro a partir de amostras ambientais de diversas matrizes, seguido da propagação e isolamento dos mesmos. Cento e oito (108) fagos foram isolados e baseados na estabilidade e título viral, vinte e quatro (24) fagos foram caracterizados morfologicamente e molecularmente. As caracterizações morfológicas e moleculares revelaram fagos pertencentes às famílias Microviridae, Inoviridae, Peduoviridae e Casjensviridae. Além disso, com os estudos moleculares foi possível avaliar a presença de genes de resistência a antibióticos associados aos fagos isolados. Os resultados confirmaram a presença de genes relacionados à resistência à beta-lactâmicos nos isolados 22 (SMLM9), 26 (PLLM1) e 31 (SMLM7). Foi avaliado o controle de L. monocytogenes em superfícies de aço inox com albumina de soro bovino (BSA) utilizando os fagos 5 (OYLM1), 19 (SULM4), 24 (SULM5), 34 (SULM6) e 37 (SMLM8). O tratamento com bacteriófagos em amostras consideradas contaminadas com matéria orgânica (3 mg/mL de proteína sérica bovina) alcançou reduções variando de 0.005?1.273 logs UFC/mL de L. monocytogenes, em relação ao grupo controle não tratado com fagos. Este estudo destaca a eficiência dos bacteriófagos 5 (OYLM1), 19 (SULM4), 24 (SULM5), 34 (SULM6) e 37 (SMLM8) no controle de L. monocytogenes em meio líquido e em superfície de inox, o que incentiva o escalonamento dos testes em plantas de processamento de alimentos.

Abstract: Listeria is a genus comprising rod-shaped, gram-positive, and facultative anaerobic bacteria. This genus includes several species, with Listeria monocytogenes being the most studied due to its pathogenesis. Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen that stands out in the food industry due to its high resistance to salinity and low pH, ability to grow at low temperatures, and ability to form biofilms. The survival and persistence of this pathogen in food processing environments are directly related to the increased risk of cross-contamination of food products, potential mechanisms of resistance, and the creation of protected microenvironments that culminates in the persistence of certain strains. Faced with the challenges surrounding L. monocytogenes in the food industry, coupled with the increasing prevalence of bacterial resistance to antibiotics, new biotechnological approaches must be developed and improved to control microbial growth. In this context, bacteriophages emerge as a useful and effective alternative for bacterial biocontrol, given their self-regulatory activity, low toxicity to eukaryotic cells, and ability to lyse the target host. The present work aimed to bioprospect new phages and apply them on surfaces aiming at the biocontrol of Listeria monocytogenes. For this purpose, induction of in vitro bacteriophage infections was performed using environmental samples from different matrices, followed by their propagation and isolation. One hundred and eight (108) phages were isolated and based on stability and viral titer, twenty-four (24) phages were characterized morphologically and molecularly. Morphological and molecular characterizations revealed phages belonging to the Microviridae, Inoviridae, Peduoviridae, and Casjensviridae families. In addition, with molecular studies, it was possible to evaluate the presence of antibiotic resistance genes associated with isolated phages. The results confirmed the presence of genes related to beta-lactam resistance in isolates 22 (SMLM9), 26 (PLLM1), and 31 (SMLM7). The control of L. monocytogenes on stainless steel surfaces with bovine serum protein (BSA) was evaluated using phages 5 (OYLM1), 19 (SULM4), 24 (SULM5), 34 (SULM6) and 37 (SMLM8). Treatment with bacteriophages in samples considered to be contaminated with organic matter (3 mg/mL of bovine serum protein) achieved reductions ranging from 0.005?1.273 logs CFU/mL of L. monocytogenes, in relation to the control group not treated with phages. This study highlights the efficiency of bacteriophages 5 (OYLM1), 19 (SULM4), 24 (SULM5), 34 (SULM6), and 37 (SMLM8) in the control of L. monocytogenes in a liquid medium and on stainless steel surface, which encourages the scaling up testing in food processing plants.