Validação de quatro marcadores genéticos sugestivos para displasia do quadril canino em uma população de raças variadas a partir de amostras de mucosa oral

Abstract

A displasia do quadril canino (DQC) é uma doença ortopédica complexa com alta prevalência em cães, sobretudo nos de grande porte. A DQC tem como característica a frouxidão excessiva da articulação do quadril provocando instabilidade e desgaste da cartilagem articular. Embora a etiologia não seja compreendida, estudos indicam que apresenta um padrão de herança poligênica influenciada por fatores ambientais. A maior parte dos marcadores genéticos sugestivos para a DQC foi encontrada em estudos com apenas uma raça e podem variar entre as populações caninas. Sendo assim, este estudo teve como objetivo identificar associações do fenótipo DQC com quatro marcadores genéticos já descritos na literatura, bem como comparar a variabilidade genética entre as populações estudadas na literatura com a população do presente estudo. Os marcadores selecionados compreendiam: região intergênica no CFA1 entre os genes NOX3 e ARID1D (genes associados com a degradação da cartilagem e com a frouxidão articular, respectivamente - SNP BICF2P468585); região próxima ao gene NOG no CFA9 (afeta o desenvolvimento articular - SNP BICF2G630834826); região intergênica no CFA28 entre os genes NANOS1 e CACUL1 (regula positivamente uma proteína colagenolítica e associado ao ciclo celular, respectivamente - SNP BICF2P1046032); e o gene FBN2 no CFA11 (proporciona estabilidade mecânica e propriedades elásticas aos tecidos conjuntivos). Foram incluídos 25 cães de raças variadas com (20 cães) e sem (5 cães controle) displasia clinicamente detectável, confirmados por exame clínico e radiográfico. Os tutores preencheram um questionário sobre o cotidiano dos cães com o intuito de relacionar os efeitos ambientais com o fenótipo displásico. As coletas das amostras de DNA da mucosa oral foram padronizadas e otimizadas com dois swabs visando uma abordagem não invasiva e simples. O DNA extraído foi amplificado por PCR para cada marcador e sequenciado pelo método de Sanger. A variabilidade genética foi realizada após a análise de similaridade das sequências obtidas por sequenciamento e também a partir de sequências disponíveis nos bancos de dados. Em relação ao porte, 60% são de porte médio, 16% de porte grande, 12% de porte pequeno e 12% de porte gigante. Não foram encontradas associações significativas para o marcador BICF2P468585 com o fenótipo displásico. O genótipo homozigoto A foi encontrando apenas em cães displásicos para o marcador BICF2G630834826 e o genótipo homozigoto contendo a base C apenas em cães displásicos para o marcador BICF2P1046032. Para este último marcador, foi identificada a inserção de um nucleotídeo A próximo à região do SNP em cães que apresentavam a base A na posição do SNP. Para o marcador FBN2, o genótipo homozigoto mutante foi encontrado em cães displásicos, podendo estar relacionado com o fenótipo displásico. A frequência dos alelos encontrada, através das análises de similaridade, foi semelhante às encontradas pelo estudo. Por conta do número amostral, não foi possível realizar maiores inferências sobre estes marcadores na população estudada. No entanto, as particularidades encontradas poderão ser exploradas com um número amostral maior, para que futuramente seja possível desenvolver um teste de diagnóstico precoce e preciso.

Abstract: Canine hip dysplasia (CHD) is a complex orthopedic disease with a high prevalence in dogs, mainly in large dog breeds. CHD is characterized by the laxity of the hip joint, it causes instability and wear of the articular cartilage. Although the etiology is not well understood, some studies indicate the influences of polygenic inheritance and environmental factors. In literature, most of the suggestive markers for DQC were found only in a few dog breeds with variation among canine populations. Therefore, this study aimed to identify associations of the CHD phenotype with four suggestive genetic markers: the intergenic region on chromosome 1 between NOX3 and ARID1D genes (genes associated with cartilage degradation and joint laxity, respectively ? SNP BICF2P468585); the region close to the NOG gene on chromosome 9 (affects joint development ? SNP BICF2G630834826); the intergenic region on chromosome 28 between NANOS1 and CACUL1 genes (upregulates a collagenolytic and cell cycle-associated protein, respectively ? SNP BICF2P1046032); and inside the gene coding to fibrillin 2 on chromosome 11(provides mechanical stability and elastic properties to connective tissues). Twenty-five dogs of mixed breeds with (20 dogs) and without (5 control dogs) clinically detectable dysplasia, confirmed by clinical and radiographic examination, were included. The tutors filled out a questionnaire about the dog?s daily life in order to relate environmental effects with the dysplastic phenotype. The collections of DNA samples from the oral mucosa were standardized and optimized with two swabs aiming at a non-invasive and simple approach. The extracted DNA was amplified by PCR for each marker and sequenced by Sanger. Genetic variability was performed after analyzing the similarity of the sequences obtained by sequencing and also from sequences available in the databases. Regarding size, 60% are medium-sized, 16% large, 12% small and 12% giant. No significant associations were found for the marker BICF2P468585 with the dysplastic phenotype. The homozygous genotype A was found only in dysplastic dogs for the marker BICF2G630834826 and the homozygous genotype containing the base C only in dysplastic dogs for the marker BICF2P1046032. For this marker, the insertion of an A nucleotide near the SNP region was identified in dogs that had the A base at the SNP position. For the FBN2 marker, the homozygous mutant genotype was found in dysplastic dogs, which may be related to the dysplastic phenotype. The frequency of alleles found through similarity analysis was similar to those found by the study. Due to the sample size, it was not possible to make further inferences about the markers in the population studied. However, the particularities found can be explored with a larger sample number, so that in the future it is possible to develop an early and accurate diagnostic test.