Coencapsulation of doxorubicin and indocyanine green in functionalized polyglobalide nanoparticles

Abstract

A fototerapia tem despertado grande interesse na comunidade científica devido à sua baixa invasividade, toxicidade, efeitos adsorvidos reduzidos e falta de resistência a drogas no tratamento do câncer. Terapias como a Fotodinâmica e Fototérmica compreendem a administração de um fotossensibilizador (FS) que ao absorver luz no comprimento de onda específico, produz uma resposta citotóxica ao tecido tumoral, seja por liberação de espécies reativas citotóxicas de oxigênio ou liberação de calor. Apesar de ser uma técnica pouco invasiva, ainda existem limitações clínicas na aplicação devido ao baixo acúmulo do fotossensibilizador (FS) no tecido tumoral e ao seu curto tempo de circulação sanguínea, seja pela sua desativação por biomoléculas ou pela sua baixa solubilidade no meio. Essas limitações podem ser superadas com a encapsulação do fotossensibilizador, melhorando sua estabilidade e controlando sua fotoatividade. Este trabalho tem como objetivo encapsular o agente fotossensibilizador Verde de Indocianina (ICG) e o Quimioterápico Cloridrato de Doxorubicina (DOX) em nanopartículas (NPs) de Poli(Globalide) (PGl). O PGl foi sintetizado via Polimerização Enzimática de Abertura de anel a 65ºC usando Novozym 435, Candida antarctica B lipase imobilizada (Cal-B), como biocatalisador. Nanopartículas coencapsulando ICG e a DOX foram preparadas pela técnica de Dupla Emulsão por Evaporação do Solvente e foram analisadas quanto ao tamanho hidrodinâmico de partícula e índice de polidispersão (PDI) por Dispersão Dinâmica de Luz (DLS). O PGl e as NPs foram caracterizados quanto a sua estrutura química, propriedades térmicas e peso molecular. A eficiência de encapsulação (EE%), do ICG e DOX, foi determinada por Espectroscopia Ultravioleta-visível e Fluorescência, respectivamente. Diferentes formulações e condições experimentais foram avaliadas, sendo que nas condições otimizadas, NPs com menos de 300 nm e PDI < 0,2 foram obtidas. As imagens de TEM revelaram o formato esférico das nanopartículas e corroboraram com os tamanhos submicrométricos determinados por DLS. As EE% do ICG em PGL NPs, para as 4 formulações (em triplicata) foram maiores que 83.2 ± 0.4 % e de 59.5 ± 2.2 % para a DOX. Assim, a técnica de dupla emulsão provou ser uma estratégia eficiente para encapsular ICG e DOX, de maneira isolada (ICG) ou duplamente carregada em NPs de PGl. Corroborando com a literatura, houve um aumento na taxa de EE% do ICG quando adicionado à DOX na formulação de NPs, com aumento de cerca de 8,5%. Além disso, as nanopartículas foram funcionalizadas com Albumina Sérica Bovina (BSA) por adsorção e quantificadas pelo Método de Lowry, com adsorção de > 58%, resultando em um bom recobrimento da superfície. Durante 6 meses foi conduzido um estudo de 6 meses e as NPs demonstraram estabilidade, mantendo seu tamanho hidrodinâmico e pH. Foram investigados os perfis de liberação do ICG e DOX nas formulações F2 (5 mg de ICG) e F4 (5 mg de ICG e 1,25 mg de DOX) em diferentes valores de pH (5.5 e 7.4), simulando ambientes biológicos relevantes. Foi observado que a presença de DOX acelerou a liberação de ICG em pH fisiológico e ácido, com o ICG liberando mais rápido em pH fisiológico, enquanto a DOX demonstrou um aumento na liberação em pH 5.5. Para o estudo de citotoxicidade em células de fibroblastos L929, concentrações de NPs abaixo de 168,7 ng mL-1 (NPs sem funcionalização de BSA) não foram citotóxicas após 24 horas de incubação, com viabilidade celular acima de 70%. Nos testes em células de linhagem tumoral SKMEL-28, utilizando um laser de 808 nm, o tempo de irradiação foi um fator determinante na terapia fotodinâmica/fototérmica, irradiação em 10 minutos produziu os melhores resultados, com atividade metabólica entre 70% e 80%.

Abstract: Phototherapy has aroused great interest in the scientific community due to its low invasiveness, toxicity, reduced adsorbed effects and lack of drug resistance in the treatment of cancer. Therapies such as Photodynamic and Photothermal involve the administration of a photosensitizer (PS) that, when absorbing light at a specific wavelength, produces a cytotoxic response to the tumor tissue, either by releasing cytotoxic reactive oxygen species or releasing heat. Despite being a non-invasive technique, there are still clinical limitations in its application due to the low accumulation of the photosensitizer (FS) in the tumor tissue and its short blood circulation time, either due to its deactivation by biomolecules or its low solubility in the environment. These limitations can be overcome by encapsulating the photosensitizer, improving its stability and controlling its photoactivity. This work aims to encapsulate the photosensitizing agent Indocyanine Green (ICG) and the chemotherapy drug Doxorubicin Hydrochloride (DOX) in Poly(Globalide) (PGl) nanoparticles (NPs). PGl was synthesized via Ring Opening Enzymatic Polymerization at 65ºC using Novozym 435, immobilized Candida antarctica B lipase (Cal-B), as biocatalyst. Nanoparticles coencapsulating ICG and DOX were prepared by the Double Emulsion by Solvent Evaporation technique and were analyzed for hydrodynamic particle size and polydispersity index (PDI) by Dynamic Light Scattering (DLS). PGl and NPs were characterized regarding their chemical structure, thermal properties and molecular weight. The encapsulation efficiency (EE%) of ICG and DOX was determined by Ultraviolet-visible Spectroscopy and Fluorescence, respectively. Different formulations and experimental conditions were evaluated, and under optimized conditions, NPs with less than 300 nm and PDI < 0.2 were obtained. The TEM images revealed the spherical shape of the nanoparticles and corroborated the submicrometer sizes determined by DLS. The EE% of ICG in PGL NPs, for the 4 formulations (in triplicate) were greater than 83.2 ± 0.4% and 59.5 ± 2.2% for DOX. Thus, the double emulsion technique proved to be an efficient strategy to encapsulate ICG and DOX, singly (ICG) or doubly loaded in PGl NPs. Corroborating the literature, there was an increase in the EE% rate of ICG when added to DOX in the formulation of NPs, with an increase of approximately 8.5%. Furthermore, the nanoparticles were functionalized with Bovine Serum Albumin (BSA) by adsorption and quantified by the Lowry Method, with adsorption of > 58%, resulting in good surface coverage. A 6-month study was conducted and the NPs demonstrated stability, maintaining their hydrodynamic size and pH. The release profiles of ICG and DOX were investigated in formulations F2 (5 mg of ICG) and F4 (5 mg of ICG and 1.25 mg of DOX) at different pH values (5.5 and 7.4), simulating relevant biological environments. It was observed that the presence of DOX accelerated the release of ICG at physiological and acidic pH, with ICG releasing faster at physiological pH, while DOX demonstrated an increase in release at pH 5.5. For the cytotoxicity study on L929 fibroblast cells, concentrations of NPs below 168.7 ng mL-1 (NPs without BSA functionalization) were not cytotoxic after 24 hours of incubation, with cell viability above 70%. In tests on cells of the SKMEL-28 tumor lineage, using an 808 nm laser, the irradiation time was a determining factor in photodynamic/photothermal therapy, irradiation in 10 minutes produced the best results, with metabolic activity between 70% and 80% .