Imobilização de xilose isomerase de streptomyces sp. F-1 em microrreator capilar de sílica

Abstract

Microrreatores são dispositivos em microescala (com canais de tamanho específico < 1000 µm) usados ??para reações químicas sob fluxo contínuo. Possuem uma alta razão entre a área superficial e o volume do microrreator, o que permite a obtenção de maior eficiência na transferência de massa e aumento na taxa de transferência de calor, entre muitas outras vantagens. Uma aplicação da tecnologia, em conjunto com a técnica de imobilização enzimática (fixação de enzimas em um suporte sólido), consiste no aumento da eficiência de reações catalisadas por enzimas. Uma enzima industrialmente relevante é a xilose (glicose) isomerase, que desempenha um papel importante na transformação de glicose em frutose usada na produção de xarope de milho rico em frutose, onde é empregada na forma imobilizada em itens superiores a 107 toneladas por ano, e de xilose em xilulose, que tem sido exaustivamente estudado para aplicação no processo de produção de etanol de segunda geração (E2G) no setor de energia renovável. Uma lacuna importante é o equilíbrio químico dessa ocorrência que favorece a formação de xilose em relação à xilulose em uma proporção de 5:1. O uso de microrreatores pode superar desafios relacionados à taxa de ocorrência química (com o aumento da transferência de massa) e ainda modificar a razão do equilíbrio (através da remoção contínua do produto). Com base no exposto, neste estudo, um microrreator capilar foi empregado para a imobilização de xilose isomerase passa a conversão dos substratos frutose e xilose em seus isômeros, glicose e xilulose, respectivamente, a fim de se obter respostas referentes ao emprego do microrreator em comparação com a enzima livre em termos de desempenho dessas respostas sob condições idênticas. Neste contexto, as reações de isomerização foram realizadas utilizando xilose isomerase obtidas de uma nova cepa do gênero Streptomyces (Streptomyces sp. F-1) imobilizada na superfície de um microrreator capilar operando sob fluxo contínuo. As respostas foram avaliadas em condições pré-estipuladas de temperatura, pH e concentração de íons com a enzima livre e imobilizada. Pode-se constatar que o método de imobilização foi bem-sucedido. Ao operar o microrreator com xilose isomerase imobilizada usando frutose sob fluxo contínuo à 2 µL·min-1 e à 4 µL·min-1, os valores de Km foram de 0,088 M e 25,477 M e de Vm foram de 0,264 µmol·min- 1·mL-1 e 0,955 µmol·min-1·mL-1, respectivamente. Com a enzima livre, o valor de Km foi de 3.282 M e de Vm foi de 0,848 µmol·min -1·mL-1. Para a operação com xilose, o microrreator com a enzima imobilizada sob fluxo contínuo a 2 µL·min-1 apresentou valores de Km e Vm (em média) de 0,033 M e 0,03 M µmol·min-1·mL-1, respectivamente. Com a enzima livre, os valores foram de 0,045 M e 0,307 µmol·min-1·mL-1, respectivamente.

Abstract: Microreactors are microscale devices (with characteristic channel sizes < 1000 µm) used to perform chemical reactions under continuous flow. They have a high ratio of surface area to volume, which allows for greater mass transfer efficiency and increased heat transfer rate, among many other advantages. One application of this technology, combined with the technique of enzyme immobilization (fixing enzymes on a solid support), is the increased efficiency of enzyme-catalyzed reactions. One industrially relevant enzyme is xylose (glucose) isomerase, which plays an important role in the conversion of glucose to fructose used in the production of high fructose corn syrup, where it is employed in immobilized form in quantities exceeding 107 tons per year. Additionally, it is utilized in the conversion of xylose to xylulose, which has been extensively studied for application in the second-generation ethanol production (E2G) process in the renewable energy sector. An important gap is the chemical equilibrium of this reaction, which favors the formation of xylose over xylulose in a ratio of 5:1. The use of microreactors can overcome challenges related to the rate of the chemical reaction (by increasing mass transfer) and modify the equilibrium ratio (through continuous product removal). Based on the above, in this study, a capillary microreactor was employed for the immobilization of xylose isomerase aiming to convert fructose and xylose substrates into their isomers, glucose and xylulose, respectively, in order to obtain responses regarding the use of the microreactor in comparison to free xylose isomerase in terms of the performance of these reactions under identical conditions. In this context, the isomerization reaction of fructose to glucose and xylose to xylulose was carried out using xylose isomerase obtained from a new strain of the Streptomyces genus (Streptomyces sp. F-1), immobilized on the surface of a capillary microreactor operating under continuous flow. The effect of the reaction was evaluated using pre-established conditions of temperature, pH, and ion concentration with immobilized xylose isomerase and free xylose isomerase. It was found that the immobilization method was successful. When operating the microreactor with immobilized xylose isomerase using fructose under continuous flow at 2 µL·min-1 and 4 µL·min-1, the Km values were 0.088 M and 25.477 M, and the Vm values were 0.264 µmol·min-1·mL-1 and 0.955 µmol·min-1·mL-1, respectively. For free xylose isomerase, the Km value was 3.282 M, and the Vm value was 0.848 µmol·min-1·mL-1. Regarding the operation with xylose, the microreactor with immobilized xylose isomerase under continuous flow at 2 µL·min-1 showed average Km and Vm values of 0.033 M and 0.03 µmol·min-1·mL-1, respectively. For free xylose isomerase, the values were 0.045 M and 0.307 µmol·min-1·mL-1, respectively. The variations in the Km and Vm values observed for the immobilized xylose isomerase compared to the free xylose isomerase suggest that limitations in mass transfer may have occurred due to immobilization, indicating that for the determination of a superior kinetic potential of the enzyme immobilized in the microreactor compared to its free form, the development of a more robust immobilization method is required.