Estudo da aplicabilidade de sequenciamento shotgun por nanoporos para detecção viral em esgoto sanitário de Canasvieiras - Florianópolis-SC

Abstract

A vigilância genômica é uma importante ferramenta para detecção e monitoramento da dispersão de patógenos, e pode ser utilizada para o acompanhamento de mutações, emergência de variantes e identificação de mecanismos de escape imunológico. No contexto da saúde única, em que a saúde humana, animal e do ecossistema estão interligadas e interdependentes, a vigilância genômica possui aplicabilidade à detecção de disseminação de agentes microbianos resistentes a tratamento. A detecção de vírus em esgoto por qPCR já foi empregada para monitoramento de surtos de poliomielite, Ebola e, recentemente, SARS-CoV-2. O protocolo de concentração viral baseado no uso de Polietileno Glicol (PEG) como agente concentrador é amplamente utilizado para ensaios que visam concentrar e na sequência detectar tais partículas usando métodos moleculares e de cultura celular. Florianópolis, por ser uma cidade turística, apresenta um aumento populacional no verão, fator que aumenta a descarga de esgoto e possibilidade de transmissão de vírus de rota orofecal, fato que torna o esgoto sanitário uma ferramenta potencial para monitorar circulação e introdução viral no ambiente. Desta forma, este projeto buscou analisar o viroma total do esgoto de Canasvieiras, de dez meses do ano de 2021, como um ensaio acerca da aplicação da metodologia de concentração por PEG, que já é empregada para detecção molecular, para sequenciamento por nanoporos pela metodologia shotgun. Dois experimentos de sequenciamento foram realizados utilizando vírus controles, para: (i) detecção de concentração mínima necessária para recuperação de sequências virais; (ii) avaliação de protocolo de PEG seguido de pós protocolos de clarificação e remoção de DNA bacteriano livre. Levando em conta estes resultados, o protocolo PEG + clorofórmio e butanol (CB) foi empregado para concentração viral de dez amostras de dez meses da estação de tratamento de esgoto de Canasvieiras do ano 2021. Estas amostras foram sequenciadas, sem adição de quaisquer controles virais, pela metodologia shotgun em equipamento MinION Mk1C. Resultados prévios de detecção dos vírus da Hepatite A, Mastadenovírus humano (Adenovírus) e SARS-CoV-2 por qPCR foram utilizados como controles positivos das amostras, a fim de verificar a recuperação dos mesmos no sequenciamento. Em caráter comparativo, seis amostras de esgoto de outras cidades do estado de Santa Catarina foram utilizadas para obtenção do genoma de SARS-CoV-2, por meio de amplicons do genoma viral, sequenciados pela tecnologia Illumina. Diferentes concentrações de vírus controles não refletiram em diferenças na recuperação de fragmentos de leitura virais. A aplicação do protocolo de clarificação associado ao método de concentração por PEG recuperou, proporcionalmente, maior número de fragmentos de leitura viral, com cerca de 26% do total sequenciado. O emprego desta metodologia nas amostras de Canasvieiras/Florianópolis-SC, recuperou apenas os fagos Shigella phage SfMu e Escherichia phage Mu. Não foram recuperados vírus previamente identificados por metodologia molecular nas mesmas amostras. O protocolo de concentração PEG mesmo que associado ao CB, sem otimização experimental e variação de componentes (pH, temperatura, tempo de centrifugação) não apresentou eficiência na recuperação de vírus previamente detectados por RT-qPCR e qPCR nas amostras de esgoto de Canasvieiras. As sequências de SARS-CoV-2 obtidas a partir de amostras de esgoto não reconstruíram completamente o genoma do vírus, indicando desafios como inespecificidade de primers e degradação de material genético. Há, portanto, a perspectiva para desenvolvimento da otimização do processo baseado em PEG, teste de novas metodologia e estudos de iniciadores para PCR em multiplex visando o sequenciamento dos de genomas virais alvo a serem aplicados na vigilância genômica de vírus entéricos ou de rota ambiental.

Abstract: Genomic surveillance is an important tool for detecting and monitoring the spread of pathogens and can be used to monitor mutations, and the emergence of variants and identify immune escape mechanisms. In the context of one health, in which human, animal and ecosystem health are interconnected and interdependent, genomic surveillance has applicability to detect the spread of treatment-resistant microbial agents. Virus detection in sewage by qPCR has already been used to monitor outbreaks of polio, Ebola and, recently, SARS-CoV-2. The viral concentration protocol based on the use of Polyethylene Glycol (PEG) as a concentrating agent is widely used for assays that aim to concentrate and then detect such particles using molecular and cell culture methods. Florianópolis, as a tourist city, experiences a population increase in the summer, a factor that increases sewage discharge and the possibility of transmission of viruses via the orofecal route, a fact that makes sanitary sewage a potential tool for monitoring circulation and viral introduction into the environment. In this way, this project sought to analyze the total virome of sewage from Canasvieiras, from ten months of the year 2021, as a test on the application of the PEG concentration methodology, which is already used for molecular detection, for nanopore sequencing using the methodology shotgun. Two sequencing experiments were carried out using control viruses, to: (i) detect the minimum concentration necessary to recover viral sequences; and (ii) evaluate of PEG protocol followed by postclarification protocols and removal of free bacterial DNA. Taking these results into account, the PEG + chloroform and butanol (CB) protocol was used for the viral concentration of ten samples from ten months of the Canasvieiras sewage treatment plant in the year 2021. These samples were sequenced, without adding any viral controls, using the shotgun methodology on MinION Mk1C equipment. Previous results of the detection of Hepatitis A viruses, human Mastadenovirus (Adenovirus) and SARS-CoV-2 by qPCR were used as positive controls for the samples, in order to verify their recovery in sequencing. On a comparative basis, six sewage samples from other cities in the state of Santa Catarina were used to obtain the SARS-CoV-2 genome, through viral genome amplicons, sequenced using Illumina technology. Different concentrations of control viruses did not reflect differences in the recovery of viral reading fragments. The application of the clarification protocol associated with the PEG concentration method recovered, proportionally, a greater number of viral reading fragments, with around 26% of the total sequenced. The use of this methodology in samples from Canasvieiras/Florianópolis-SC recovered only the Shigella phage SfMu and Escherichia phage Mu phages. No viruses previously identified by molecular methodology were recovered from the same samples. The PEG concentration protocol, even when associated with CB, without experimental optimization and variation of components (pH, temperature, centrifugation time) was not efficient in recovering viruses previously detected by RT-qPCR and qPCR in sewage samples from Canasvieiras. SARS-CoV-2 sequences obtained from sewage samples did not completely reconstruct the virus genome, indicating challenges such as primer unspecificity and degradation of genetic material. There is, therefore, the prospect of developing optimization of the PEG-based process, testing new methodology and studying primers for multiplex PCR aimed at sequencing target viral genomes to be applied in the genomic surveillance of enteric or environmental viruses.