Desenvolvimento de metodologias de infecção e diagnóstico de ZIKV direcionadas à identificação dos sítios de infecção em embriões de Gallus gallus

Abstract

O vírus Zika (ZIKV) é um Flavivírus. Seu principal modo de transmissão é vetorial, através do mosquito Aedes aegypti. O ZIKV foi descoberto em 1947 na floresta Zika, em Uganda, na África, mas só recebeu atenção especial de organizações internacionais de saúde em 2015 e 2016. Nesse período, o ZIKV foi pela primeira vez associado a diversos casos de malformações congênitas, sendo a microcefalia a mais grave delas. Estudos mostram que o ZIKV tem preferência por progenitores neurais, mas isso não explica totalmente algumas das malformações observadas em embriões infectados pelo ZIKV. A fim de identificar faixas etárias e regiões anatômicas potencialmente suscetíveis à infecção pelo ZIKV, nesse trabalho foram realizadas uma série de infecções pelo ZIKV em embriões de Gallus gallus, que são naturalmente suscetíveis à infecção pelo ZIKV humano. Em nossos testes, as infecções por ZIKV foram realizadas diretamente in ovo na região cardíaca dos embriões com 72h e 96h de desenvolvimento (E3 e E4, respectivamente), com intervalo de 24h entre a infecção e a retirada do embrião para análise. As análises revelaram que houve aproximadamente 19 vezes mais replicação viral em embriões infectados em E4 quando comparados aos infectados no E3. Além disso, os embriões infectados em E4 apresentaram uma taxa de suscetibilidade à infecção pelo ZIKV de 78,78%, superior às taxas de E3, que foram de 33,30%. Para identificar as regiões com maior presença de ZIKV, foi desenvolvida uma sonda de RNA marcada com digoxigenina, direcionada especificamente para o ZIKV. Cabeças de embriões infectados com idade de E3 foram submetidas à hibridização in situ (ISH), que teve como objetivo mapear as regiões anatômicas com maior presença do ZIKV. Embora os resultados da marcação sejam muito preliminares, a sonda mostrou marcações em áreas como telencéfalo, olhos e arcos braquiais, áreas conhecidas pela presença do ZIKV. Esses resultados ajudarão a identificar não apenas regiões específicas, mas também novos locais de infecção pelo ZIKV em embriões inteiros, permitindo ampliar nosso conhecimento sobre as ações do ZIKV durante o desenvolvimento.

Abstract: The Zika virus (ZIKV) is a member of the Flavivirus genus, primarily transmitted through vectors, specifically the Aedes aegypti mosquito. ZIKV was initially discovered in 1947 in the Zika forest in Uganda, Africa. However, it only garnered significant attention from international health organizations in 2015 and 2016. During this period, ZIKV was first associated with various cases of congenital malformations, with microcephaly being the most severe among them. Studies propose that ZIKV exhibits a preference for neural progenitors. However, this doesn't entirely explain certain malformations observed in embryos infected with the virus. In order to discern age ranges and anatomical regions that are potentially susceptible to ZIKV infection, this study conducted a series of ZIKV infections in embryos of Gallus gallus, which are naturally susceptible to human ZIKV infection. In our experiments, ZIKV infections were directly administered in ovo to embryos at 72 hours and 96 hours of development (E3 and E4, respectively), with a 24-hour interval between infection and embryo retrieval for analysis. The analyses revealed that there was approximately 19-fold change viral replication in embryos infected at E4 compared to those infected at E3. Moreover, embryos infected at E4 exhibited a susceptibility rate to ZIKV infection of 78.78%, surpassing the rates of E3, which were 54.20%. To pinpoint regions with a higher ZIKV presence, a digoxigenin-labeled RNA probe was developed, specifically targeting ZIKV. Heads of embryos infected at E3 were subjected to in situ hybridization (ISH), aimed at mapping anatomical regions with a greater ZIKV presence. While the results of the labeling are preliminary, the probe exhibited markings in areas such as the telencephalon, eyes, and branchial arches regions known for ZIKV presence. These findings will not only aid in identifying specific regions but also new sites of ZIKV infection in entire embryos, thereby enhancing our understanding of ZIKV actions during development.