Desenvolvimento de linhagens recombinantes de Saccharomyces cerevisiae capazes de fermentar celobiose

Abstract

O etanol utilizando biomassa vegetal, chamado de etanol de segunda geração (2G), é uma alternativa para aumentar a produção de biocombustíveis e diminuir a dependência de fontes fósseis. Para isso, são necessárias etapas de pré-tratamento da biomassa e hidrólise de polissacarídeos para liberação de açúcares que podem ser consumidos. A adição de enzimas ß-glicosidases no coquetel enzimático de hidrólise, para hidrólise de celobiose, é o que mais encarece essa etapa. O desenvolvimento de linhagens de leveduras capazes de transportar e hidrolisar intracelularmente celobiose seria interessante para diminuir os custos de obtenção do hidrolisado e ao mesmo tempo pode permitir a integração entre produção convencional (1G) e 2G. Com esse objetivo, o presente trabalho desenvolveu linhagens recombinantes de Saccharomyces cerevisiae, tanto laboratoriais quanto industriais, expressando o transportador de celobiose MgCBT2 e a enzima SpBGL2, uma ß-glicosidase intracelular, analisando suas capacidades de consumo de celobiose e produção de etanol. A enzima apresentou capacidade de hidrólise de celobiose e de p-nitrofenil-ß-d-glicopiranosídeo (pNßG), um análogo à celobiose, e de p-nitrofenil-ß-d-xilopiranosídeo (pNßX), análogo à xilobiose, com maior velocidade e afinidade para pNßG. O transportador MgCBT2 também apresentou capacidade de transporte tanto de pNßG quanto de pNßX, com maior desempenho sobre o primeiro. Foi observado um decréscimo na atividade de transporte de linhagens fermentando celobiose e consequente diminuição na velocidade fermentativa e se optou pela truncagem das extremidades N- e/ou C- terminais da proteína de forma a remover os resíduos de lisina que podem ser ubiquitinados e promover a endocitose e posterior degradação. Além da utilização correta de condições de cultivo, os resultados demonstram que a estratégia de truncagem foi eficiente para melhorar o consumo de celobiose, sendo que a versão do transportador truncado em ambas as extremidades permitiu consumo de toda a celobiose do meio fermentativo. Para testar a possibilidade de utilização de algumas linhagens desenvolvidas servirem como plataformas iSUCCELL (metabolizar sacarose e celobiose intracelularmente) e integrar a produção 1G e 2G, foram realizados ensaios de co-fermentação contendo sacarose e celobiose. As linhagens conseguiram consumir ambos os dissacarídeos, porém, o consumo de celobiose piorou em relação à fermentação contendo apenas celobiose. Quando se analisa esses resultados e se compara com outras evidências na literatura, pode-se concluir que plataformas iSUCCELL são interessantes, porém esbarram em características fisiológicas de S. cerevisiae que precisariam ser modificadas para permitir a fermentação de celobiose. Em suma, o estudo destaca a viabilidade do desenvolvimento de linhagens de S. cerevisiae capazes de consumir celobiose, o que pode representar um avanço na produção de etanol de segunda geração a partir da biomassa lignocelulósica, contribuindo para a busca de soluções mais sustentáveis no setor de biocombustíveis.

Abstract: A second-generation ethanol derived from plant biomass, known as 2G ethanol, serves as an alternative to increase biofuel production and decrease reliance on fossil fuel sources. Achieving this involves several steps, including biomass pre-treatment and polysaccharide hydrolysis to release consumable sugars. The addition of ß-glucosidase enzymes in the enzymatic hydrolysis cocktail, for cellobiose hydrolysis, significantly raises costs in this stage. Developing yeast strains capable of transporting and intracellularly hydrolyzing cellobiose could reduce the costs of obtaining the hydrolysate and potentially allow the integration between conventional (1G) and 2G production. This study aimed to develop recombinant strains of Saccharomyces cerevisiae, both in laboratory and industrial settings, expressing the cellobiose transporter MgCBT2 and the enzyme SpBGL2, an intracellular ß-glucosidase. The analysis focused on their abilities to consume cellobiose and produce ethanol. The enzyme demonstrated the capacity to hydrolyze cellobiose and p-nitrophenyl-ß-d-glucopyranoside (pNßG), an analogue of cellobiose, and p-nitrophenyl-ß-d-xylopyranoside (pNßX), an analogue of xylotriose, with higher speed and affinity for pNßG. The transporter MgCBT2 also showed the ability to transport both pNßG and pNßX, performing better with the former. A decrease in transport activity was observed in strains fermenting cellobiose, resulting in a subsequent reduction in fermentation rate. Truncation of the N- and/or C-terminal ends of the protein was opted for to remove lysine residues that could be ubiquitinated, promoting endocytosis and subsequent degradation. Alongside appropriate cultivation conditions, the results demonstrate that the truncation strategy effectively improved cellobiose consumption. The version of the transporter truncated at both ends allowed for complete consumption of cellobiose from the fermentative medium. To explore the possibility of using developed strains as iSUCCELL platforms (metabolizing sucrose and cellobiose intracellularly) and integrating 1G and 2G production, co-fermentation assays containing sucrose and cellobiose were conducted. The strains managed to consume both disaccharides; however, cellobiose consumption worsened in comparison to fermentation containing only cellobiose. When analyzing these results and comparing them with other evidence in the literature, it can be inferred that iSUCCELL platforms are promising but face physiological characteristics of S. cerevisiae that would need modification to enable cellobiose fermentation. In summary, the study highlights the feasibility of developing S. cerevisiae strains capable of consuming cellobiose, potentially advancing second-generation ethanol production from lignocellulosic biomass. This contributes to the pursuit of more sustainable solutions in the biofuel sector.