Otimização da técnica de eletroporação de construção plasmidial de DNA em embriões de Gallus gallus

Abstract

O estudo da biologia do desenvolvimento é fundamental na compreensão dos complexos e instigantes processos que conduzem a formação e diferenciação de organismos multicelulares. Nesse contexto, as células da Crista Neural (CN) desempenham um papel crucial no desenvolvimento dos vertebrados, contribuindo para a formação de estruturas importantes como nervos periféricos, glândulas, ossos e cartilagens craniofaciais. O destino e a diferenciação da CN dependem de uma rede regulatória de genes. Compreender como esses genes são ativados, regulados e interagem durante o desenvolvimento é essencial para desvendar os segredos da morfogênese e da especialização celular. A técnica de eletroporação destaca-se como uma ferramenta valiosa para essa investigação. Ao permitir a introdução eficiente de material genético nas células, a eletroporação possibilita a manipulação controlada da expressão de genes, podendo oferecer insights precisos sobre a função dos genes envolvidos no desenvolvimento, permitindo uma melhor compreensão dos eventos moleculares que moldam o desenvolvimento embrionário. O objetivo central deste trabalho foi padronizar um protocolo para a execução otimizada da técnica de eletroporação in vivo em embriões de Gallus gallus domesticus, com enfoque nas células da CN. Para otimizar a técnica, foram realizados experimentos de eletroporação in ovo utilizando uma construção de DNA plasmidial CAGGS- EGFP. Variações na voltagem da eletroporação (3, 6, 9, 12 e 15 volts) foram realizadas a fim de encontrar a melhor condição. Os resultados indicaram que eletroporações realizadas a 12 volts foram mais eficientes para a transfecção. O uso de voltagens maiores mostrou-se diretamente proporcional ao aumento da mortalidade e intensificou a manifestação de malformações embrionárias. O protocolo aplicado revelou-se eficiente na marcação das células da CN na região cefálica do embrião. Além disso, a expressão persistente da proteína EGFP, utilizada como reporter, foi observada até pelo menos 72 horas após a eletroporação. Essas conclusões ressaltam a necessidade de otimização cuidadosa dos parâmetros experimentais para alcançar resultados eficientes e robustos. Assim, a combinação do estudo da biologia do desenvolvimento, com foco nas células da CN, e a aplicação da técnica de eletroporação abre novas perspectivas para desvendar os mistérios da formação e diferenciação celular durante o desenvolvimento embrionário, promovendo avanços significativos no conhecimento biológico e potencialmente contribuindo para aplicações terapêuticas com foco nas neurocristopatias.

The study of developmental biology is crucial for understanding the complex and intriguing processes that lead to the formation and differentiation of multicellular organisms. In this context, Neural Crest (NC) cells play a crucial role in vertebrate development, contributing to the formation of important structures such as peripheral nerves, glands, bones, and craniofacial cartilage. The fate and differentiation of NC cells depend on a regulatory gene network. Understanding how these genes are activated, regulated, and interact during development is essential to unravel the secrets of morphogenesis and cell specialization. Electroporation stands out as a valuable tool for this investigation. By allowing efficient introduction of genetic material into cells, electroporation enables controlled manipulation of gene expression, providing precise insights into the function of genes involved in development and a better understanding of the molecular events shaping embryonic development. The central objective of this work was to standardize a protocol for the optimized execution of in vivo electroporation in embryos of Gallus gallus domesticus, with a focus on NC cells. To optimize the technique, in ovo electroporation experiments were conducted using a CAGGS-EGFP plasmid DNA construct. Electroporation voltage variations (3, 6, 9, 12, and 15 volts) were tested to find the optimal condition. The results indicated that electroporations at 12 volts were more efficient for transfection. The use of higher voltages was directly proportional to increased mortality and intensified the occurrence of embryonic malformations. The applied protocol proved effective in labeling NC cells in the embryonic cephalic region. Furthermore, persistent expression of the EGFP protein, used as a reporter, was observed for at least 72 hours after electroporation. These findings emphasize the need for careful optimization of experimental parameters to achieve efficient and robust results. Thus, the combination of developmental biology studies, with a focus on NC cells, and the application of electroporation opens new perspectives for unraveling the mysteries of cell formation and differentiation during embryonic development, promoting significant advances in biological knowledge and research.