Determinação dos intermediários do ciclo do ácido tricarboxílico em urina de seres humanos por eletroforese capilar

Abstract

O ciclo do ácido tricarboxílico é fundamental para a produção de energia no corpo humano e, portanto, é importante manter seu equilíbrio. Perturbações no ciclo podem ser refletidas nas concentrações de seus intermediários. A metabolômica busca determinar essas concentrações para ajudar a identificar fenótipos de doenças e elucidar o mecanismo e progressão de diferentes condições de saúde. A abordagem metabolômica pode ser untargeted (global) ou targeted (dirigida). A metabolômica global visa avaliar o maior número de metabólitos possíveis de uma matriz biológica, enquanto a metabolômica dirigida tem como objetivo avaliar metabólitos ou vias metabólicas específicos. Neste trabalho, foi utilizada a metabolômica dirigida para avaliar o ciclo do ácido tricarboxílico. Foi desenvolvido um método para a determinação dos intermediários do ciclo do ácido tricarboxílico (ácidos a-cetoglutárico, cítrico, fumárico, lático, málico e succínico) por eletroforese capilar de zona com detector UV-Vis. O eletrólito utilizado foi composto por 24 mmol L-1 de ácido 2,6-piridinocarboxílico, 76 mmol L-1 de ß-alanina e 4 mmol L-1 de hidróxido de hexadeciltrimetilamônio (CTAOH) em pH = 4. As separações foram realizadas em um capilar de sílica fundida com comprimento total de 100 cm e diâmetro interno de 75 µm. A injeção das amostras foi feita por injeção hidrodinâmica (100 mBar 5 s-1) e a detecção foi realizada no modo indireto em 290 nm. O método foi validado e apresentou linearidade adequada (R2 > 0,9922) para todos os analitos. Os limites de detecção obtidos foram 0,24 — 1,84 mg L-1 e de quantificação, 0,74 — 5,57 mg L-1. O método foi aplicado para determinar os ácidos em amostras de urina de pacientes afetados por obesidade antes de serem submetidos a cirurgia bariátrica e um ano após a cirurgia. Os ácidos cítrico, lático, málico e a- cetoglutárico foram quantificados nas amostras. Para avaliar se as mudanças nas concentrações dos ácidos eram decorrentes de mudanças metabólicas resultantes da cirurgia, foi realizada uma análise de componentes principais (PCA). Não houve diferença entre os grupos de amostras, indicando que não ocorreram mudanças significativas no ciclo no intervalo de coleta estudado. No entanto, os dados obtidos sugerem que o método pode ser usado para quantificar os intermediários do ciclo do ácido tricarboxílico em urina de seres humanos.

Abstract: The tricarboxylic acid cycle is essential to energy production in the human body and, therefore, it is important to maintain its homeostasis. Disturbances in the cycle may be reflected in the concentrations of its intermediates. Metabolomics aims to determine the concentrations of these intermediates to help identify disease phenotypes and elucidate the mechanism and progression of different health conditions. The analysis approach can be untargeted or targeted. Untargeted metabolomics provides an analysis of the maximum number of molecules in a biological matrix, while targeted metabolomics evaluates specific metabolites or metabolic pathways. In this work, targeted metabolomics was applied to evaluate the tricarboxylic acid cycle. It was developed a method for the determination of the tricarboxylic cycle intermediates (a-ketoglutaric, citric, fumaric, lactic, malic, and succinic acids) by capillary zone electrophoresis equipped with a UV-Vis detector. The background electrolyte consisted of 24 mmol L-1 2,6-pyridine carboxylic acid, 76 mmol L- 1 ß-alanine, and 4 mmol L-1 hexadecyltrimethylammonium hydroxide (CTAOH) (pH 4). The separations were carried out in a fused-silica capillary of 100 cm total length and 75��m of internal diameter. The injection mode used was hydrodynamic (100 mBar 5 s-1) and the detection was carried out in indirect mode at 290 nm. The method was validated and showed an appropriate linearity (R2 > 0,9922) for all the analytes. The limits of detection obtained ranged from 0,24 to 1,84 mg L-1 and the limits of quantification, from 0,74 to 5,57 mg L-1. The method was applied to determine the acids in urine samples from patients affected by obesity before being submitted to bariatric surgery and one year after the surgery. Citric, lactic, malic, and a-ketoglutaric acids were quantified in the analyzed samples. To evaluate if the variation in the concentration of the acids was due to the surgery, a principal component analysis (PCA) was carried out. There was no difference between the two sets of samples, indicating that no significant changes happened in the cycle during the period evaluated in this study. However, the obtained data indicate that the method can be used to quantify the tricarboxylic acid cycle intermediates in human urine.