Padronização de um método de isolamento e caracterização de pequenas vesículas extracelulares de fluidos biológicos humanos

Abstract

As doenças inflamatórias crônicas abrangem uma ampla gama de patologias que envolvem respostas imunológicas persistentes. Biomarcadores são ferramentas valiosas para a compreensão da fisiopatologia e do manejo clínico destas condições, sendo essenciais a sua identificação para a eficácia do tratamento e/ou a melhoria do prognóstico. Entretanto, ainda existem desafios a serem superados para melhorar a aplicação clínica de biomarcadores, incluindo a pouca estabilidade de diversos compostos ou a indisponibilidade de marcadores em fluidos biológicos que apresentam pouca invasividade. Neste cenário, as vesículas extracelulares (VEs) pequenas (tamanho entre 30-200 nm) apresentam-se em fluidos como plasma e urina emergiram como fonte de biomarcadores promissores para a detecção, prognóstico e terapia de numerosas condições inflamatórias. As pequenas VEs são conhecidas por transportar proteínas, citocinas, RNAs (incluindo miRNAs), de células emissoras que podem modular a resposta inflamatória nas células receptoras. Embora as expectativas sejam positivas pela busca de biomarcadores em VEs, ainda há deficiências de protocolos, econômicos e de alta eficiência, que permitem o isolamento de VEs de fluidos biológicos como plasma e urina. Neste estudo, definimos um protocolo que permitiu o isolamento de pequenos fluidos humanos por meio do uso de ultracentrifugação diferencial. Para a padronização do protocolo, amostras de plasma e urina de voluntários foram diluídas (1:10; V/V) em solução de salina distribuída fosfato, filtradas (filtro hidrofílico de 0,22µm) e submetidas a diferentes condições de centrifugação (3.000 ? 12.000 xg) e ultracentrifugação (45.000 ? 200.000 xg). O diâmetro hidrodinâmico médio (Z-average) das VEs isoladas foi avaliado usando a técnica de propagação sonora de luz (DLS). Uma microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foi utilizada para avaliar a morfologia e confirmar a integridade e o tamanho dos VEs. As vesículas mais purificadas de plasma resultaram de duas centrifugações a 3.000 xg por 20 min e 12.000 xg por 30 min, seguidas por uma etapa de ultracentrifugação de 45.000 xg por 1 h. As suspensões de vesículas geraram suspensões com um Z-average de 125 nm, que é feito com o tamanho de pequenos VEs. O mesmo protocolo foi aplicado em amostras de urina; no entanto, uma etapa de ultracentrifugação foi realizada a 45.000 xg por 1 h. A análise DLS mostrou vesículas com um Z-average de 148 nm nas amostras de urina. Uma análise por TEM mostrou vesículas delimitadas por uma bicamada lipídica com tamanho entre 30 ? 130 nm sem sinais claros de agregações ou danos à sua estrutura. Como exemplo a identificação da carga das VEs isoladas foi determinada a concentração de proteínas totais, RNA e a expressão do gene DHFR, a qual foi realizada por RT-qPCR em amostras de urina de indivíduos afetados por doença pulmonar intersticial associada à artrite reumatóide e em indivíduos saldáveis. Em conclusão, foi implementado um protocolo robusto e econômico para isolamento de pequenos VEs de plasma e urina. Este avanço facilita a investigação da relevância dessas vesículas na compreensão das doenças inflamatórias e, potencialmente, no desenvolvimento de estratégias terapêuticas futuras.

Abstract: Major Depressive Disorder (MDD) is a complex psychiatric disorder characterized by depressive mood, and somatic and neurovegetative alterations, which affects many people around the world and is one of the main public health problems. It has a multifactorial origin, and oxidative stress and neuroinflammation are associated with the development of depressive symptoms. Current treatments are based on modulating the monoaminergic system, but their effectiveness is limited. The association of compounds with antidepressant effects has therefore been sought as a therapeutic strategy for MDD. Vitamin D is a hormone with various regulatory functions and its receptors are abundant in the brain. Zinc is a trace element that has antioxidant, anti-inflammatory and immune system effects. There is evidence that both compounds have an antidepressant effect in pre-clinical and clinical studies. The aim of this study was to evaluate the antidepressant effect of vitamin D and zinc chloride alone or in combination in a model of depression induced by lipopolysaccharide (LPS). For this purpose, female Swiss mice were administered cholecalciferol (1000 IU/kg/day) and/or zinc chloride (10 mg/kg/day) for 7 days. On day 7, the animals received an intraperitoneal injection of LPS (0.5 mg/kg) and after 24 hours of the protocol, the behavioral tests were carried out: Tail suspension test, (TST) open field test (OFT) and splash test (ST), to assess whether the treatments were effective in preventing LPS-induced depressive-like behavior. In addition, levels of malondialdehyde (MDA), non-protein thiols (indicative of reduced glutathione content) and nitrite/nitrate (NOx, indicative of nitric oxide levels) were measured in the prefrontal cortex. The administration of LPS elicited depressive-like behavior, as evidenced by the significant increase in immobility time in the TST, which was prevented by treatment with cholecalciferol, zinc and a combination of these compounds. Mice challenged with LPS showed anxiety-like behavior when compared to the control group in the OFT, as the animals that received LPS had a higher latency to enter the center and start grooming, decreased center time and increased grooming time in the OFT. In the ST LPS-exposed mice had a longer latency time compared to the control group. Cholecalciferol and/or zinc were effective in preventing the behavioral alterations induced by LPS in the TST as well as in the latency to enter the center in the OFT and in the ST. Regarding biochemical parameters, the animals challenged with LPS showed an increase in MDA and NOx levels and a reduction in non-protein thiols, and the treatments were able to prevent these alterations. These results indicate that cholecalciferol, zinc and a combination of these compounds have a potential antidepressant-like effect in a model of depression mediated by an inflammatory challenge, and that this effect is associated with a prevention of biochemical alterations related to oxidative damage in the prefrontal cortex.