mRNA encapsulation in lipid nanoparticles formulations for macrophage-based immunotherapy and pulmonary lung delivery

Abstract

Nas últimas décadas, o uso de agentes terapêuticos baseados em ácidos nucleicos tem sido amplamente investigado para o desenvolvimento de terapias genéticas, tornando-se uma estratégia interessante para o tratamento de diversos tipos de doenças pulmonares, desde condições hereditárias até câncer. A imunoterapia pode ser feita pela modulação de células do sistema imune inato, como os macrófagos. A administração de mRNA requer um transportador apropriado capaz de evitar sua degradação, e garantir sua expressão sem gerar efeitos colaterais indesejados. Nesse contexto, as nanopartículas lipídicas (NPLs) são atualmente a melhor plataforma aprovada pela FDA para a administração in vivo de mRNA. No entanto, para maximizar ainda mais os benefícios das terapias baseadas em mRNA, é preferível direcionálas diretamente ao local-alvo específico. Assim, o objetivo deste trabalho foi propor uma formulação de NPLs para a encapsulação de mRNA e investigar o uso dessas NPLs para a entrega pulmonar de medicamentos como ferramenta de imunoterapia baseada em macrófagos. Duas formulações à base de lecitina foram investigadas para a encapsulação do mRNA-Revilla em emulsão dupla água/óleo/água (A/O/A) usando duas abordagens diferentes de emulsificação ultrassônica. Ambas as formulações e abordagens de emulsificação permitiram a produção de NPLs submicrométricas estáveis e capazes de encapsular a molécula de mRNA. A presença de cera de abelha na formulação promoveu a inibição completa de células HEK 293T nas concentrações testadas. A formulação composta apenas por lecitina de soja e Crodamol mostrou-se o sistema de entrega de mRNA mais promissor, com uma eficiência de encapsulação de 31% e com baixos níveis de citotoxicidade em células Vero. No entanto, a expressão de mRNA em células HEK 293T não foi detectada usando o sistema de entrega a base de lecitina de soja e Crodamol. A aplicação de ultrassom com uma sonda invertida para promover a emulsificação não comprometeu a integridade do mRNA. Dessa forma, lecitina de soja e Crodamol têm o potencial de serem usados como formulação alternativa para a encapsulação e entrega de mRNA. Em seguida, oito formulações diferentes de NPLs contendo mRNA-FLuc foram preparadas pela técnica de autoagregação por adição gota-a-gota, e avaliadas para a entrega direcionada de mRNA a macrófagos. Todas as formulações apresentaram tamanho submicrométrico, estabilidade coloidal e níveis de encapsulamento acima de 80%. A mistura lipídica provou ser um aspecto crucial na entrega e expressão do mRNA, impactando o nível de bioluminescência in vitro das células RAW 264.7 e K7M2. A combinação de SM-102, DOPE e ß-sitosterol teve o melhor nível geral de transfecção em células de macrófagos. Finalmente, formulações de NPLs de autoagregação contendo mRNAFLuc foram preparadas pelo método de microfluídica, o que impactou significativamente o tamanho das NPLs, atingindo um nível de encapsulamento de 90%. A entrega pulmonar in vivo da formulação composta por DLin-MC3-DMA/DSPC/colesterol/DMG-PEG carregada com mRNA-FLuc foi investigada em camundongos Balc/c, com a expressão de mRNA-FLuc apresentando um pico de bioluminescência após 6 h. O rastreamento das NPLs usando o corante DiD revelou sua presença in vivo e ex vivo nos pulmões, assim como no fluido de lavagem broncoalveolar (BALF). No entanto, mesmo sendo observada in vivo e ex vivo nos pulmões, a expressão de mRNA-FLuc não foi detectada no BALF. Assim, as NPLs são uma estratégia promissora para promover a entrega direta de mRNA aos pulmões, e o ajuste da formulação lipídica pode ser usado para direcionar as NPLs aos macrófagos, para o desenvolvimento de uma ferramenta de imunoterapia.

Abstract: Over the past few decades, nucleic acid-based therapeutic agents have been vastly investigated for gene therapy, becoming an interesting strategy for the treatment of several types of lung diseases, from hereditary conditions to cancer. Immunotherapies can be used to modulate innate immune cells, such as macrophages. The administration of extracellular mRNA demands an appropriate carrier capable of avoiding its degradation and securing the mRNA transfection and expression, without generating undesirable side effects. In this context lipid nanoparticles (LNPs) are currently the best FDA-approved platform for in vivo mRNA administration. Nevertheless, to further maximize the benefits of mRNA-based genomic medicines, they must be preferably delivered to the specific target site. Thus, the aim of the present work was to propose a bio-based LNPs formulation for mRNA encapsulation and investigate the use of these LNPs for pulmonary drug delivery as macrophage-based immunotherapy tool. Two lecithinbased formulations were investigated for water/oil/water (W/O/W) double emulsion encapsulation of Revilla-mRNA using two different approaches of ultrasonic emulsification. Both formulations and emulsification approaches allowed the production of submicrometric, and stable LNP structures, which successfully encapsulated the mRNA molecule. The presence of beeswax in the formulation promoted the complete inhibition of HEK 293T cells at the tested concentrations making unfeasible its use for the intended application. The formulation composed only of soy lecithin and Crodamol proved to be the most promising mRNA delivery system, with an encapsulation efficiency of 31% and low levels of cytotoxicity in Vero cells. However, mRNA expression in HEK 293T cells was not detected using the soy lecithin and Crodamol delivery system. The application of ultrasound using an invert probe to promote the emulsification did not compromise the mRNA integrity. In this way, soy lecithin and Crodamol have the potential to be used as alternative formulation for mRNA encapsulation and delivery. Next, eight different self-assembly LNP formulations containing FLuc-mRNA were prepared by the dropwise addition technique and screened for macrophages mRNA targeting delivery. All the formulations presented submicrometric size, stability, and encapsulation level above 80%. The lipid mixture proved to be a key aspect of the mRNA delivery and expression, impacting the in vitro bioluminescence level of RAW 264.7 and K7M2 cells, with the combination of SM-102, DOPE ß-sitosterol having the best overall transfection level in macrophages cells. Finally, self-assembly LNP formulations containing FLuc-mRNA were prepared by the microfluidics method, which significantly impacted the LNPs size and reached an encapsulation level of 90%, and also proved to be the most reproducible one. The in vivo lung delivery of the self-assembly formulation DLin-MC3-DMA/DSPC/Cholesterol/DMGPEG LNPs loaded with FLuc-mRNA was investigated on balc/c mice, with the FLuc-mRNA expression presenting a bioluminescence pic at 6 h. The LNPs tracking using DiD' dye revealed its in vivo and ex vivo presence in the lungs, as well as in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF). However, even being in vivo and ex vivo identified in lungs, the FLuc-mRNA expression was not detected in the BALF. Thus, LNPs are a promising strategy to promote the direct delivery of mRNA to the lungs, and the adjustment of the lipid formulation can be used as an advantage to target LNPs to macrophages to be used as an immunotherapy tool.