Investigação dos efeitos toxicológicos e terapêuticos do extrato hidroalcoólico das folhas de Eugenia brasiliensis Lam. em modelos de dor

Abstract

Introdução: A espécie de planta Eugenia brasiliensis Lam., popularmente conhecida como grumixama, ibaporoiti ou cereja brasileira, é amplamente utilizada com propriedades adstringentes, diuréticas, energizantes, antirreumáticas e anti-inflamatórias. No entanto, embora o uso popular da espécie seja bastante estabelecido, poucos são os estudos que exploram sua segurança e eficácia. Diante disso, este trabalho objetiva investigar os potenciais toxicológicos das folhas de Eugenia brasiliensis, bem como sua atividade terapêutica em modelos animais de dor nociceptiva, nociplástica e neuropática. Métodos: Foram utilizados camundongos Swiss machos e fêmeas. Os estudos de toxicidade aguda e em doses repetidas foram realizados seguindo os guias 425 e 407 da Organização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE), respectivamente. Inicialmente, os animais foram tratados por via intragástrica (gavagem) com doses únicas de 1000 e 2000 mg/kg do extrato hidroalcoólico de E. brasiliensis (EHEb) e, em seguida, observados quanto aos sinais tóxicos agudos e mortalidade por 14 dias. A toxicidade em doses repetidas foi avaliada ao longo de 28 dias de tratamento (doses de 30, 100, 300 e 1000 mg/kg de EHEb), através de testes comportamentais, hematológicos, bioquímicos e histológicos. A atividade antinociceptiva e anti-inflamatória aguda do EHEb (100 e 300 mg/kg) foi avaliada no modelo de dor inflamatória induzido por carragenina, através do teste de von Frey e mensuração do edema de pata. Os níveis de citocinas inflamatórias [fator de necrose tumoral-a (TNF-a), interleucina 1ß (IL1-ß) e interleucina 6 (IL-6)] da pata foram quantificados por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA); e o estresse oxidativo [atividade da mieloperoxidase (MPO), glutationa peroxidase (GSH), superóxido dismutase (SOD) e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)] foi verificado por espectrofotometria. O efeito prolongado do EHEb (300 mg/kg) foi avaliado no modelo de fibromialgia induzido por reserpina (0,25 mg/kg, subcutânea, por três dias consecutivos). Os animais foram tratados por 10 dias com EHEb e duloxetina (controle positivo), sendo que neste tempo foram avaliados parâmetros de nocicepção, coordenação motora, força, comportamento tipo-depressivo e tipo-ansioso. Ao final, os tecidos foram coletados para quantificação de citocinas inflamatórias e fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF) e seu receptor (TrkB total e fosforilado), por ELISA e Western blotting. Adicionalmente, atividade do extrato (100 e 300 mg/kg) também foi avaliada em um modelo de neuropatia induzido pelo esmagamento do nervo isquiático. Durante 13 dias realizaram-se testes de nocicepção, funcionalidade, comportamento tipo-depressivo, além de análises bioquímicas de estruturas como o nervo e a medula espinal. Resultados: As doses de EHEb utilizadas nos estudos de toxicidade aguda e em doses repetidas não foram capazes de alterar parâmetros como peso, consumo de água e ração dos animais. Também não foram observadas diferenças comportamentais, bioquímicas e histológicas importantes entre os grupos. Na análise hematológica, somente as fêmeas do grupo tratado com 1000 mg/kg apresentaram um aumento de neutrófilos e redução de leucócitos. No modelo de inflamação induzido por carragenina, observou-se que o EHEb foi capaz de reduzir a hiperalgesia mecânica, edema de pata, citocinas inflamatórias (IL-1ß e IL-6) e estresse oxidativo (analisado pelo aumento de SOD e redução de TBARS). No modelo de fibromialgia, o tratamento com EHEb foi capaz de reduzir a nocicepção, bem como os comportamentos tipo-depressivo e ansioso, além de aumentar a força dos animais, sem alterar parâmetros de locomoção e coordenação motora. Também foi observada redução significativa de citocinas inflamatórias (IL-6 e IL-1ß) no hipocampo, e um aumento dos níveis de BDNF no córtex pré-frontal dos animais tratados com EHEb. Por fim, o tratamento com EHEb também demonstrou efeitos antinociceptivos importantes na dor neuropática, além de melhorar a coordenação motora e reduzir o comportamento tipo-depressivo dos animais. Ademais, o tratamento foi capaz de reduzir a inflamação periférica, verificada através da diminuição dos níveis de IL-1ß no nervo isquiático. Conclusão: Em conjunto, estes dados fornecem evidências sobre a segurança para o uso de EHEb, além de identificar importantes efeitos analgésicos, anti-inflamatórios e comportamentais em modelos de dor aguda e prolongada em camundongos. Desta forma, destaca-se que os presentes resultados abrem caminhos para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas, ao passo que reforçam a importância da conservação da biodiversidade como fonte crucial de novas substâncias benéficas.

Abstract: Introduction: The plant species Eugenia brasiliensis Lam., commonly known as grumixama, ibaporoiti, or Brazilian cherry, is widely used for its astringent, diuretic, energizing, anti-rheumatic, and anti-inflammatory properties. However, despite the established popular use of the species, few studies have explored its safety and efficacy. Therefore, this study aims to investigate the toxicological potential of Eugenia brasiliensis leaves, as well as their therapeutic activity in animal models of nociceptive, nociplastic, and neuropathic pain. Methods: Male and female Swiss mice were used. Acute and repeated dose toxicity studies were conducted following the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) guidelines 425 and 407, respectively. Initially, animals were intragastrically treated with single doses of 1000 and 2000 mg/kg of the hydroalcoholic extract of E. brasiliensis (HEEb) and observed for acute toxic signs and mortality for 14 days. Repeated dose toxicity was assessed over 28 days of treatment (doses of 30, 100, 300, and 1000 mg/kg of HEEb) through behavioral, hematological, biochemical, and histological tests. The acute antinociceptive and anti-inflammatory activity of HEEb (100 and 300 mg/kg) was evaluated in the carrageenan-induced inflammatory pain model using the von Frey test and paw edema measurement. Inflammatory cytokines [tumor necrosis factor-a (TNF-a), interleukin-1ß (IL1-ß), and interleukin-6 (IL-6)] in the paw were quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and oxidative stress [myeloperoxidase (MPO) activity, glutathione peroxidase (GSH), superoxide dismutase (SOD), and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS)] was determined by spectrophotometry. The prolonged effect of HEEb (300 mg/kg) was assessed in the reserpine-induced fibromyalgia model (0.25 mg/kg, subcutaneous, for three consecutive days). Animals were treated for 10 days with HEEb and duloxetine (positive control), and parameters of nociception, motor coordination, strength, depressive-like, and anxious-like behavior were evaluated. Tissues were collected for the quantification of inflammatory cytokines and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and its receptor (total and phosphorylated TrkB) by ELISA and Western blotting. Additionally, the extract's activity (100 and 300 mg/kg) was evaluated in a sciatic nerve injury-induced neuropathy model. Nociception, functionality, depressive-like behavior, and biochemical analyses of structures such as the nerve and spinal cord were conducted over 13 days. Results: The doses of HEEb used in acute and repeated dose toxicity studies did not alter parameters such as weight, water, and food consumption of the animals. No significant behavioral, biochemical, or histological differences were observed between the groups. In hematological analysis, only females in the 1000 mg/kg-treated group showed an increase in neutrophils and a reduction in leukocytes. In the carrageenan-induced inflammation model, HEEb reduced mechanical hyperalgesia, paw edema, inflammatory cytokines (IL-1ß and IL-6), and oxidative stress (indicated by increased SOD and decreased TBARS). In the fibromyalgia model, HEEb treatment reduced nociception, depressive-like, and anxious-like behaviors, and increased animal strength, without altering locomotion and motor coordination parameters. A significant reduction in inflammatory cytokines (IL-6 and IL-1ß) in the hippocampus and an increase in BDNF levels in the prefrontal cortex of HEEb-treated animals were observed. Finally, HEEb treatment demonstrated significant antinociceptive effects in neuropathic pain, improved motor coordination, and reduced depressive-like behavior in animals. Additionally, treatment reduced peripheral inflammation, as evidenced by decreased levels of IL-1ß in the sciatic nerve. Conclusion: In conclusion, these data provide evidence of the safety of HEEb use and identify significant analgesic, anti-inflammatory, and behavioral effects in acute and prolonged pain models in mice. Thus, these results highlight the potential for the development of new therapeutic approaches while emphasizing the importance of biodiversity conservation as a crucial source of beneficial substances.