Avaliação do efeito do meio condicionado proveniente de fibroblastos orais senescentes sobre a viabilidade e o crescimento de células de carcinoma

Abstract

O carcinoma epidermoide de boca (CEB) permanece entre as lesões malignas com maior prevalência no Brasil e no mundo, representando mais de 90% das malignidades que acometem a cavidade oral. O desenvolvimento e progressão do CEB não se derivam somente de alterações genéticas nas células do parênquima, mas também em modificações fenotípicas e metabólicas das células presentes no estroma, em especial, os fibroblastos. Estas células, quando associadas à lesão tumoral, podem apresentar características biológicas que têm sido relacionadas a uma maior taxa de progressão e metástase da lesão. Além disso, fibroblastos também podem adquirir um fenótipo secretor associado à senescência, cujas características e perfil secretório de diversos fatores, tanto intra como extracelulares, têm sido apontados como mecanismos de promoção e disseminação de diversos tipos de cânceres. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos do meio condicionado proveniente de fibroblastos orais senescentes na viabilidade, proliferação e migração de células de CEB in vitro. Primeiramente foi feita a indução da senescência em fibroblastos provenientes de cultura primária, por meio de incubação com peróxido de hidrogênio a 30%. Foram consideradas senescentes as culturas que apresentaram pelo menos 50% de marcação positiva para a enzima β-galactosidase. Após esse processo, foi feita a cultura dos fibroblastos jovens e senescentes para a coleta do meio condicionado. Quando as culturas atingiram de 80 a 90% de confluência foi feita a incubação com meio DMEM sem soro por 48h para coleta dos meios condicionados. Células de CEB (linhagem CAL27) foram cultivadas em placas de 96 e 48 cavidades e os meios condicionados experimentais de fibroblastos senescentes (MCFS), fibroblastos jovens (MCFJ) e meio DMEM sem soro (DSS) foram adicionados para compor os grupos de intervenção, onde o controle foi realizado com meio convencional suplementado com 10% de soro fetal bovino (DCS). Para avaliação da viabilidade celular foi utilizado o método da coloração com Sulforrodamina B; para análise da migração celular o método do “Scratch” ou ranhura; e para confirmação da proliferação celular, utilizou-se a coloração fluorescente com CyQuant. Foi observado que os grupos MCFJ e MCFS apresentaram uma média de viabilidade celular superior no tempo de 24h quando comparado ao tempo de 48h (p<0,000). A migração celular no grupo DSS apresentou diferença estatística apenas entre os tempos 0h e 48h (p=0,002), assim como o grupo MCFJ (p=0,04), já o grupo com MCFS foi significativo nos tempos 24h (p=0,042) e 48h (p=0,018) quando comparados ao tempo 0h. Em relação à proliferação celular, houve diferença estatística entre o grupo controle quando comparado ao grupo DSS (p=0,027) e MCFS (p=0,034). Dessa forma, apesar das limitações que protocolos in vitro apresentam, podemos observar que houve influência positiva dos meios condicionados especialmente sobre a migração de células de carcinoma epidermoide de boca.

Oral squamous cell carcinoma (OSCC) remains one of the most prevalent malignant lesions in Brazil and worldwide, representing over 90% of malignancies affecting the oral cavity. The development and progression of OSCC are not only derived from genetic alterations in parenchymal cells but also from phenotypic and metabolic changes in stromal cells, particularly fibroblasts. These cells, when associated with the tumor lesion, can exhibit biological characteristics that have been linked to a higher rate of lesion progression and metastasis. Additionally, fibroblasts can acquire a secretory phenotype associated with senescence, whose characteristics and secretory profile of various factors, both intra- and extracellular, have been implicated as mechanisms, promoting the spread of various types of cancers. Therefore, the aim of this study was to analyze the effects of conditioned medium from senescent oral fibroblasts on the viability, proliferation, and migration of OSCC cells in vitro. Initially, senescence was induced in fibroblasts from primary culture by incubating them with 30% hydrogen peroxide. Cultures were considered senescent if they showed at least 50% positive staining for βgalactosidase enzyme. After this process, young and senescent fibroblasts were cultured to collect conditioned medium. When cultures reached 80-90% confluence, they were incubated with serum-free DMEM medium for 48 hours to collect conditioned media. OSCC cells (CAL27 cell line) were cultured in 96-well and 48-well plates, and experimental conditioned media from senescent fibroblasts (CMSF), young fibroblasts (CMYF), and serum-free DMEM (SFD) were added to form intervention groups. The control group was cultured in conventional medium supplemented with 10% fetal bovine serum (CMS). Cell viability was assessed using the Sulforhodamine B staining method; cell migration was analyzed using the scratch assay; and cell proliferation was confirmed using CyQuant fluorescent staining. It was observed that the CMYF and CMSF groups showed higher average cell viability at 24 hours compared to 48 hours (p<0.000). Cell migration in the SFD group showed statistical difference only between 0 hours and 48 hours (p=0.002), as did the CMYF group (p=0.04), whereas the CMSF group was significant at 24 hours (p=0.042) and 48 hours (p=0.018) compared to 0 hours. Regarding cell proliferation, there was statistical difference between the control group compared to the SFD (p=0.027) and CMSF (p=0.034) groups. Thus, despite the limitations inherent in in vitro protocols, it can be observed that there was a positive influence of conditioned media, especially on the migration of oral squamous cell carcinoma.