Otimização de protocolo de extração de DNA para Araucaria angustifolia e Ocotea porosa

Abstract

É possível constatar que muitas espécies florestais se encontram em risco de extinção, como Araucaria angustifolia e Ocotea porosa, o que desencadeia problemáticas ambientais, sociais e econômicas. São imprescindíveis estudos que visam a conservação dessas espécies, os quais requerem que as populações remanescentes sejam monitoradas e delas obtidas amostras para a elaboração de estudos genéticos. Para isso é necessário que haja a disponibilidade de protocolos de extração de DNA específicos para cada espécie, com o objetivo de obter amostras com qualidade e quantidade requeridas para utilização em etapas mais avançadas como a PCR, visando o uso dos marcadores moleculares. Com essa finalidade, foi utilizado o protocolo CTAB padrão com adaptações cabíveis para cada espécie. Para Araucaria angustifolia foram avaliadas diferentes técnicas de maceração do material para extração de DNA (Tissuelyser em câmbio vascular seco, lima e lixa nos tecidos de alburno). Para Ocotea porosa foram avaliadas duas concentrações de CTAB (2 e 5%) e tempos de banho-maria (1 h e 1 h e 30 min). Posteriormente, as amostras foram submetidas a eletroforese em gel de agarose a 0,8% com marcadores Lambda de peso conhecido (25, 50 e 100 ng/μL) e quantificadas através de espectrofotômetro NanoVue. Para Araucaria angustifolia a extração resultou em uma concentração média das amostras de 129 ng/μL para uso de câmbio em Tissuelyser, e para lima e lixa de 36,96 e 36,91 ng/μl, respectivamente. Além disso, a média para grau de pureza ficou acima de 1,8 para todos os testes. Para a espécie de O. porosa, as amostras extraídas em CTAB 2% em banho-maria por 1 h e 30 min foram mais expressivas do que as demais, com média de 116 ng/μl, porém para todos os testes as amostras obtiveram média de grau de pureza na faixa de 1,5 o que confere baixa qualidade das amostras.

It can be seen that many forest species are at risk of extinction, such as Araucaria angustifolia and Ocotea porosa, which is causing environmental, social and economic problems. Studies aimed at conserving these species are essential and require the remaining populations to be monitored and samples obtained from them for genetic studies. This requires the availability of specific DNA extraction protocols for each species, in order to obtain samples of the quality and quantity required for use in more advanced stages such as PCR, with a view to using molecular markers. To this end, the standard CTAB protocol was used, with appropriate adaptations for each species. For Araucaria angustifolia, different material maceration techniques were evaluated for DNA extraction (Tissuelyser on dry vascular cambium, sanding file and sandpaper on sapwood tissues). For Ocotea porosa, two concentrations of CTAB (2 and 5%) and water bath times (1 h and 1 h and 30 min) were evaluated. The samples were then subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis with Lambda markers of known weight (25, 50 and 100 ng/μL) and quantified using a NanoVue spectrophotometer. For Araucaria angustifolia, different material maceration techniques were evaluated for DNA extraction (Tissuelyser on dry vascular cambium, Sandpaper on sapwood tissues. For Ocotea porosa, two concentrations of CTAB (2 and 5%) and water bath times (1 h and 1 h and 30 min) were evaluated. The samples were then subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis with Lambda markers of known weight (25, 50 and 100 ng/μL) and quantified using a NanoVue spectrophotometer. For A. angustifolia, the extraction resulted in an average sample concentration of 129 ng/μL for use in Tissuelyser exchange, and for sanding file and sandpaper of 36.96 and 36.91 ng/μL, respectively. In addition, the average purity grade was above 1.8 for all tests. For the O. porosa species, the samples extracted in 2% CTAB in a water bath for 1 h and 30 min were more expressive than the others, with an average of 116 ng/μl, but for all the tests the samples obtained an average purity level in the 1.5 range, which confers low quality on the samples.