Modulação do metabolismo da tetraidrobiopterina em condições inflamatórias

Abstract

A inflamação sustentada é um componente comum da fisiopatologia de muitas doenças, seja como causa primária ou consequência secundária da deficiência energética e/ou estresse oxidativo. A inflamação crônica pode danificar tecidos e órgãos e contribuir para o desenvolvimento e progressão de várias condições médicas. O objetivo desta tese foi investigar o papel potencial do metabolismo de tetraidrobiopterina (BH4) como alvo-chave para modular a inflamação em condições em que os níveis de BH4 podem ser aumentados ou prejudicados. Como sistemas biológicos foram incluídos três desenhos experimentais: cultura de fibroblastos humanos com deficiência genética de uma proteína mitocondrial que é essencial para a tradução mitocondrial, o TFAM. A segunda abordagem incluiu animais submetidos a dieta rica em gordura (do inglês high fat diet ? HFD) para induzir o acúmulo visceral de tecido adiposo e expostos ao exercício físico aeróbio visando prevenir o desenvolvimento da obesidade. O terceiro desenho experimental envolveu o uso da cafeína em um modelo animal de inflamação induzida por lipopolissacarídeo (LPS). Os resultados gerados nesta tese de doutorado evidenciaram que os fibroblastos deficientes em TFAM expressam o fenótipo de deficiência energética, caracterizado por redução do consumo de oxigênio basal, extravasamento de prótons e capacidade de reserva mitocondrial, bem como inibição dos complexos da cadeia respiratória, particularmente os complexos I e IV. Além disso, foi demonstrado que o estresse oxidativo também está presente nessas células como outro componente da fisiopatologia da deficiência genética, e que a atividade das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase e superóxido dismutase foi reduzida em fibroblastos deficientes em TFAM. Além disso, a análise do transcriptoma dessas células mostrou que os genes responsáveis pela síntese de BH4 não foram regulados positivamente como seria esperado em condições metabólicas deficientes, denotando, portanto, que sob disfunção mitocondrial e estresse oxidativo, a ativação da produção de BH4 pode estar comprometida nos fibroblastos. Ainda, foi observado que os níveis de BH4 estavam patologicamente aumentados e o limiar nociceptivo diminuído nos animais expostos à HFD. O aumento dos níveis de BH4 ocorreu em paralelo com maior gordura corporal e acúmulo de tecido adiposo branco visceral, intolerância à glicose e maior glicemia de jejum. Esses dados mostram que o aumento do metabolismo da BH4 coincide com a redução nos escores de nocicepção, e que os níveis de BH4 urinária poderiam se tornar um possível biomarcador do desenvolvimento da hipersensibilidade à dor na obesidade. O exercício físico de intensidade moderada preveniu o acúmulo de tecido adiposo, além de normalizar a tolerância à glicose e o comportamento nociceptivo, desta forma, induzindo efeitos positivos na saúde. A administração de cafeína demonstrou efeitos anti-inflamatórios caracterizados pela redução da expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias Il1b e Il6, bem como dos componentes do inflamassoma Nlpr3, Asc e Casp1. Por outro lado, foi observado aumento da expressão gênica da citocina anti-inflamatória Il10. Juntamente com o LPS, a administração de cafeína provocou mudanças no perfil epigenético, promovendo a indução da metilação de novo do DNA. Em conjunto, os resultados apresentados nesta tese sugerem que o metabolismo da BH4 pode ser considerado uma faca de dois gumes, com baixos ou elevados níveis resultando em toxicidade.

Abstract: Sustained inflammation is a common component in the pathophysiology of many diseases, whether as a primary cause or secondary consequence of energy deficiency and/or oxidative stress. Tissues and organs can be damaged by chronic inflammation, and various medical conditions can be contributed to it. The potential role of tetrahydrobiopterin (BH4) metabolism as a key target for modulating inflammation in conditions where BH4 levels can be increased or impaired was investigated in this thesis. Three experimental designs were included as biological systems: culture of human fibroblasts characterized by genetic deficiency of a mitochondrial protein essential for mitochondrial translation, TFAM. The second approach involved animals that were subjected to a high-fat diet (HFD) to induce the accumulation of visceral adipose tissue and were exposed to aerobic exercise to prevent the development of obesity. The third experimental design involved the use of caffeine in an animal model of lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation. The results generated in this doctoral thesis revealed that the phenotype of energy deficiency is expressed by TFAM-deficient fibroblasts, which is characterized by reduced basal oxygen consumption, proton leakage, and mitochondrial reserve capacity, as well as inhibition of respiratory chain complexes, particularly complexes I and IV. Furthermore, it was demonstrated that oxidative stress is also present in these cells as another component of the pathophysiology of genetic deficiency, and the activity of the antioxidant enzymes glutathione peroxidase and superoxide dismutase was reduced in TFAM-deficient fibroblasts. Additionally, the transcriptome analysis of these cells showed that genes responsible for BH4 synthesis were not upregulated as expected under deficient metabolic conditions, indicating that activation of BH4 production may be compromised in fibroblasts under mitochondrial dysfunction and oxidative stress. It was also observed that BH4 levels were pathologically increased, and the nociceptive threshold was decreased in animals exposed to HFD. The increase in BH4 levels occurred parallel to higher body fat and accumulation of visceral white adipose tissue, glucose intolerance, and elevated fasting blood glucose. These data demonstrate that increased BH4 metabolism coincides with reduced nociception scores, and urinary BH4 levels could become a potential biomarker for the development of obesity-related hypersensitivity to pain. The accumulation of adipose tissue was prevented, glucose tolerance was normalized, and nociceptive behavior was induced positively on health by moderate-intensity physical exercise. Anti-inflammatory effects were demonstrated by caffeine administration, characterized by the reduction of gene expression of pro-inflammatory cytokines Il1b and Il6, as well as components of the inflammasome Nlpr3, Asc, and Casp1. On the other hand, an increase in gene expression of the anti-inflammatory cytokine Il10 was observed. Alongside LPS, changes in the epigenetic profile were induced by caffeine administration, promoting de novo DNA methylation. Together, the results presented in this thesis suggest that BH4 metabolism can be considered a double-edged sword, with low or high levels resulting in toxicity.