Otimização do processo de biorrefinaria aplicado à microalga Phaeodactylum tricornutum utilizando metabolômica e biologia computacional

Abstract

As microalgas são consideradas modelos biotecnológicos promissores à produção de compostos de alto valor econômico. Dentre as espécies promissoras, Phaeodactylum tricornutum tem se destacado, por sintetizar compostos como o ácido eicosapentenóico (EPA) e o carotenoide fucoxantina (FCX). Com isto em vista, este trabalho pretende criar subsídios para gerar hipóteses que permitam otimizar o processo de biorrefinaria aplicado à P. tricornutum, utilizando tecnologias ômicas e biologia computacional. Para tanto, o metabolismo daquela espécie foi investigado simultaneamente através de análises direcionadas, como as cromatografias líquida e gasosa, e não direcionadas, utilizando-se as espectroscopias de infravermelho médio (FTIR) e ressonância magnética nuclear. O objetivo desta estratégia de investigação foi descrever o metaboloma de P. tricornutum CCAP 1052/1A, a fim de encontrar padrões de dados que forneçam informações relevantes à otimização da produção dos metabólitos de interesse. O Capítulo I consiste em uma revisão de literatura do estado da arte da área de engenharia metabólica aplicada à biorrefinaria da espécie. No capítulo II foram testadas 5 metodologias de extração de ácidos graxos de interesse, i.e., Bligh e Dyer, com e sem processamentos físicos, Folch e Stanley e Selstam e Ölquist, sendo a metodologia de Bligh e Dyer a mais efetiva e prática. No capítulo III, com o auxílio de análises metabolômicas, foi avaliada a estabilidade da molécula de FCX sob determinadas condições de armazenamento, de modo a fornecer evidências sobre o seu comportamento molecular para assim estabelecer os melhores protocolos visando a qualidade das análises. No capítulo IV, com o auxílio de tecnologias ômicas, foi possível melhor compreender o metabolismo da espécie, a fim de traçar estratégias de cultivo in vitro à otimização da biossíntese de EPA e FCX. Buscou-se também identificar vias metabólicas potenciais para serem inibidas, a fim de aumentar a síntese dos compostos de interesse. Os resultados revelaram máximos conteúdos de EPA e FCX no 4º dia de cultivo e, dentre as vias metabólicas a inibir, o ciclo do glioxilato, da alanina e do piruvato mostraram-se mais promissores à otimização da biossíntese e acúmulo daqueles compostos. Por fim, o capítulo V apresenta os resultados de estratégias de modulação metabólica descritas no capítulo IV, de modo a aumentar os teores dos compostos de interesse. Os cultivos de P. tricornutum CCAP 1052/1A, suplementados com cloreto de magnésio, quercetina e oxalato de amônio demonstraram grande potencial ao incremento da biossíntese e acúmulo de EPA e FCX, sendo sugerida sua avaliação em sistemas de cultivo em biorreatores de grande escala.

Abstract: Microalgae are considered promising biotechnological models for the production of compounds of high economic value. Among the promising species, Phaeodactylum tricornutum has stood out, synthesizing compounds such as eicosapentaenoic acid and the carotenoid fucoxanthin (FCX). With this in mind, this work intends to create subsidies and generate hypotheses that allow optimizing the biorefinery process applied to P. tricornutum, using omics technologies and computational biology. Therefore, the metabolism of that species was investigated simultaneously through directed analyses, such as liquid and gas chromatography, and undirected analysis, using mid-infrared (FTIR) and nuclear magnetic resonance spectroscopy. The objective of this investigation strategy was to describe the metabolome of the species of interest and to find data patterns that provide information relevant to the optimization of the production of the metabolites of interest. Chapter I consists of a literature review of the state of the art in the area of metabolic engineering applied to the biorefinery of the species. In chapter II, 5 methods of extracting fatty acids of interest were tested, i.e., Bligh and Dyer, with and without physical processing, Folch and Stanley and Selstam and Ölquist, with the Bligh and Dyer methodology being the most effective and practical. In chapter III, with the help of metabolomics analyses, the stability of the FCX molecule under certain storage conditions was evaluated, to provide evidence of its molecular behavior to establish the best processes aiming at the quality of the analyses. In chapter IV, with the help of omics technologies, it was possible to better understand the metabolism of the species and to outline in vitro culture strategies to optimize the biosynthesis of EPA and FCX. We also sought to identify potential metabolic pathways to be inhibited to increase the synthesis of compounds of interest. The results revealed maximum EPA and FCX contents on the 4th day of cultivation and, among the metabolic pathways to be inhibited, the glyoxylate, alanine, and pyruvate cycles were the most promising for optimizing the biosynthesis and accumulation of these compounds. Finally, in chapter V some of the strategies generated in chapter IV are applied, to increase the levels of the compounds of interest. The P. tricornutum cell cultures supplemented with magnesium chloride, quercetin, and ammonium oxalate showed great potential to increase the biosynthesis and accumulation of EPA and FCX, being suggested for its evaluation in cultivation systems in large-scale bioreactors.