Otimização da produção de painéis liofilizados e de Dried Tubes Specimen (DTS), e validação do painel de HBV para implementação na AEQ-TR e AEQ-CV do Programa Nacional de Avaliação Externa da Qualidade

Abstract

As infecções sexualmente transmissíveis (ISTs), como sífilis, hepatites virais e a infecção pelo HIV, representam um grande desafio para a saúde pública mundial. Reúnem-se esforços de vários âmbitos para diminuição dessa problemática, entre eles o cuidado com a aquisição de testes diagnósticos e o treinamento dos profissionais executantes. Além do treinamento, é essencial a participação em ensaios de proficiência que avaliam o conhecimento e prática do profissional, por exemplo, no Programa Nacional de Avaliação Externa da Qualidade (AEQ), uma parceria do DATHI/MS e do LBMMS/UFSC. Os painéis de amostras enviados neste Programa, sofrem constantes melhorias e otimização dos processos de produção devido ao aumento da demanda de participantes e preocupação em garantir a qualidade dos elementos dos painéis AEQ. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi o aprimoramento do processo de liofilização de amostras de plasma e otimização da produção de painéis DTS, juntamente com a validação de amostras reativas para HBV para implementação em ambos os painéis. No capítulo 1, apresentamos os resultados da validação do painel de HBV na AEQ-CV. Com o intuito de verificar a estabilidade da carga viral, as amostras foram liofilizadas e submetidas ao armazenamento em geladeira (2 a 8ºC), a temperatura ambiente (20 a 26ºC), a 35ºC e a 45ºC por 42 dias e posteriormente, quantificadas no equipamento Cepheid – GeneXpert®. O painel de HBV apresentou bons resultados, mantendo carga viral estável na maioria das condições às quais foi submetido, a exceção foi a 45ºC em que a amostra teve problemas de dissolução. A possível recuperação da amostra nesta temperatura será testada com a adição da trealose. O painel de HBV foi validado e passará a fazer parte da AEQ-CV. No capítulo 2, visando melhorar a estabilidade e diminuir a queda da carga viral das amostras para testar a carga viral de HIV, HCV e HBV liofilizadas, adicionou-se 10% de trealose. Após o processo de liofilização, as amostras puras e com trealose foram armazenadas em geladeira, a temperatura ambiente, a 35ºC e a 45ºC durante 42 dias e testadas no equipamento Cepheid – GeneXpert® para avaliação da sua estabilidade. Os resultados demonstram que as amostras desses agravos quando adicionadas de trealose apresentaram melhor dissolução do liofilizado e estabilidade, na carga viral das amostras liofilizadas, no decorrer dos 42 dias, quando comparadas com amostras puras (sem trealose). Portanto, devido a proteção gerada pela trealose nas amostras, aumentando sua estabilidade e garantindo sua dissolução, este aditivo será incorporado no preparo dos painéis da AEQ-CV. No capítulo 3, realizou-se a validação do painel do marcador HBsAg na AEQ-TR, aplicando-se a metodologia DTS. Os painéis DTS foram armazenados em ambientes úmidos e secos, e levados à geladeira, à temperatura ambiente, à estufa 35ºC e à estufa 45ºC. O painel de AEQ-TR-HBV apresentou bons resultados, com reatividade até o 40º dia em ambiente seco submetido à geladeira, temperatura ambiente e estufa 35ºC, e até 30 dias em estufa 45ºC. As amostras submetidas a ambiente úmido tiveram seus resultados e dissolução das amostras afetados, permanecendo reagentes apenas quando armazenados em geladeira e temperatura ambiente durante os 40 dias. Como os testes com o painel DTS de HBsAg apresentaram resultados reagentes, relativamente boa dissolução em ambiente seco e em larga escala de temperaturas, este foi validado e será incluído na AEQ-TR. No capítulo 4, foi otimizada a produção dos painéis da AEQ-TR. Amostras DTS foram congeladas por até 180 dias em freezer -20ºC e -80ºC e testadas por 30 dias após o descongelamento. Com exceção das amostras DTS para sífilis que tiveram sua estabilidade afetadas pelo congelamento, as demais amostras reagentes para HIV, HCV e HBsAg apresentaram bons resultados mesmo após 180 dias de congelamento em ambas as temperatura (-20ºC e -80ºC), com pouco ou nenhum enfraquecimento da intensidade da cor da linha de teste. Dessa forma, essa metodologia será implementada na produção dos painéis, otimizando o processo e melhorando a rotina laboratorial.

Sexually transmitted infections (STIs), such as syphilis, viral hepatitis and HIV infection, represent a major challenge for global public health. Efforts are being made from various areas to reduce this problem, including criteria for the acquisition of diagnostic tests and the training of professionals. In addition to training, it is essential to participate in proficiency tests that evaluate the professional's knowledge and practice, for example, in the National Program for External Quality Assessment (EQA), a partnership between DATHI/MS and LBMMS/UFSC. The panels sent in this Program undergo constant improvements and optimization of production processes due to the increase in demand from participants and the concern to guarantee the quality of the elements of the EAQ panels. Therefore, the objective of this study was to improve the freeze-drying process of plasma samples and optimize the production of DTS panels, besides the validation of reactive samples for HBV for implementation in both panels. In chapter 1, we present the results of the validation of the HBV panel in the EQA-VL. In order to verify the stability of the viral load, the samples were freeze-dried and subjected to storage in a refrigerator (2 to 8ºC), at room temperature (20 to 26ºC), at 35ºC and 45ºC for 42 days and subsequently quantified in the equipment: Cepheid – GeneXpert®. The HBV panel showed good results, maintaining a stable viral load in most of the conditions, the exception was at 45ºC where the sample had dissolution problems. The possible recovery of the sample at this temperature will be tested with the addition of trehalose. The HBV panel has been validated and will become part of the EQA-VL. In chapter 2, in order to improve stability and reduce the drop in the viral load of samples lyophilized for HIV, HCV and HBV, 10% trehalose was added. After the freeze-drying process, the pure samples and those with trehalose were stored in a refrigerator, at room temperature, at 35ºC and 45ºC for 42 days and tested on the Cepheid – GeneXpert® equipment to evaluate their stability. The results demonstrate that samples with trehalose showed better dissolution of the lyophilisate and stability, in the viral load over the 42 days, when compared to pure samples (without trehalose). Therefore, due to the protection generated by trehalose in the samples, increasing their stability and ensuring their dissolution, this additive will be incorporated in the preparation of the EQA-VL panels. In chapter 3, the HBsAg panel was validated in the EQA-RT, applying the DTS methodology. The DTS panels were stored in humid and dry environments, and placed in the refrigerator, at room temperature, at 35ºC and at 45ºC. The EQA-HbsAg panel showed good results, with reactivity up to the 40th day in a dry environment subjected to the refrigerator, room temperature and at 35ºC, and up to 30 days at 45ºC. Samples submitted to a humid environment had their results and sample dissolution affected, remaining reactive only when stored in a refrigerator, at room temperature for 40 days. As tests with the HBsAg DTS panel showed reactive results, relatively good dissolution in a dry environment and over a wide range of temperatures, it was validated and will be included in the EQA-RT. In chapter 4, the production of EQA-RT panels was optimized. DTS samples were frozen for up to 180 days in a -20ºC and -80ºC freezer and tested for 30 days after thawing. With the exception of the DTS samples for syphilis, which had their stability affected by freezing, the other reactive samples for HIV, HCV and HBsAg showed good results even after 180 days of freezing at both temperatures (-20ºC and -80ºC), with poor no weakening in the color intensity of test line. This methodology will be implemented in the production of panels, optimizing the process and improving the laboratory routine.