O metabolismo da tetraidrobiopterina se encontra prejudicado em deficiências mitocondriais genéticas e induzidas quimicamente

Abstract

O metabolismo da tetraidrobiopterina (BH4) emergiu recentemente como um novo alvo metabólico que pode ser modulado positivamente para compensar processos tóxicos que podem resultar em morte celular. Nosso grupo demonstrou recentemente que a BH4 em concentrações fisiológicas é essencial para um apropriado metabolismo e dinâmica mitocondrial, para a regulação da resposta inflamatória, e para a ativação das defesas antioxidantes. Considerando que as doenças mitocondriais são caracterizadas por déficits energéticos, estresse oxidativo e inflamação, o objetivo deste trabalho foi investigar se o metabolismo da BH4 se encontra comprometido em duas deficiências mitocondriais. O metabolismo da BH4 e a fisiologia e dinâmica mitocondrial foram investigados nos tecidos e fluídos de uma deficiência energética induzida quimicamente pela administração de reserpina em roedores e em fibroblastos obtidos de indivíduos acometidos por distúrbio mitocondrial primário genético, a deficiência em DARS2. A deficiência de DARS2 é caracterizada por leucoencefalopatia com envolvimento do tronco encefálico e da medula espinhal, bem como elevação de ácido lático central e periférico. A reserpina é empregada para indução experimental da doença de Parkinson, atuando como um inibidor do transportador vesicular da dopamina e comprometendo a sinalização dopaminérgica. O metabolismo da BH4 foi caracterizado pela mensuração da expressão gênica e atividade das principais enzimas biossintéticas da BH4. A expressão gênica diferencial foi avaliada pela análise do transcriptoma. A fisiologia mitocondrial foi investigada pela avaliação das atividades dos complexos na cadeia respiratória, e a dinâmica mitocondrial por microscopia eletrônica de transmissão (MET). Os fibroblastos de indivíduos afetados pela deficiência em DARS2 foram estabelecidos a partir de biópsias de pele de dois irmãos afetados (Paciente 1: 8 anos e Paciente 2: 4 anos) e de um irmão assintomático, que não é portador (Controle). Os camundongos que receberam reserpina mostraram inibição do complexo I da cadeia respiratória no estriado e alterações na dinâmica mitocondrial caracterizadas por aumento no tamanho e ramificação da mitocôndria no músculo esquelético. Essas alterações estiveram associadas a níveis reduzidos de BH4 no cérebro, no soro e na urina. Os fibroblastos deficientes em DARS2 exibiram atividades reduzidas dos complexos I e IV da cadeia respiratória. A análise do transcriptoma revelou a regulação negativa de genes envolvidos na produção de BH4 e de várias proteínas mitocondriais relacionadas à produção de energia, incluindo as subunidades dos complexos I, III, IV e V, bem como a regulação positiva de genes ligados à ativação da resposta à hipóxia. Esse comprometimento no metabolismo da BH4 foi confirmado pela avaliação da expressão de GCH1, gene chave envolvido na produção de BH4. Além disso, a atividade de GTPCH (codificada por GCH1) não foi modificada quando estimulada com o ativador canônico, lipopolissacarídeo (LPS; 24 h; 2 mg/mL). A redução na capacidade de síntese de BH4 não foi justificada pela presença de polimorfismos de nucleotídeo único no gene GCH1, os que previamente tinham sido reportados por estarem associados a uma síntese reduzida de BH4. A informação apresentada neste trabalho mostra uma nova e íntima associação entre a fisiologia e dinâmica mitocondrial comprometidas com a deficiência de BH4 em tecidos com alta demanda energética. Assim, pode ser postulado que a administração de BH4 pode resultar em uma nova abordagem para o tratamento de distúrbios mitocondriais, principalmente os de origem genética, para os quais não existe terapia eficaz.

Abstract: The metabolism of tetrahydrobiopterin (BH4) has recently emerged as a new metabolic target that can be positively modulated to counterbalance toxic processes that can result in cell death. Our group recently demonstrated that BH4 in physiological concentrations is essential for proper mitochondrial metabolism and dynamics, for the regulation of the inflammatory response, and for the activation of the antioxidant defenses. Considering that mitochondrial diseases are characterized by energy deficits, oxidative stress and inflammation, the objective of this work was to investigate whether BH4 metabolism is compromised in two mitochondrial deficiencies. BH4 metabolism and mitochondrial physiology and dynamics were investigated in tissues and fluids from two system with energy deficiency. One of them was chemically induced by the administration of reserpine in rodents. The second one was represented by fibroblasts obtained from individuals affected by the genetic mitochondrial disorder, DARS2 deficiency. DARS2 deficiency is characterized by leukoencephalopathy with brain stem and spinal cord involvement, as well as elevated central and peripheral lactic acid. Reserpine is used by the scientific community for the experimental induction of Parkinson's disease. Reserpine inhibits the vesicular dopamine transporter, compromising dopaminergic signaling. BH4 metabolism was characterized by measuring gene expression and activity of the main BH4 biosynthetic enzymes. Differential gene expression was assessed by the analysis of the transcriptome. Mitochondrial physiology was investigated by evaluating the activities of the enzymatic complexes present in the respiratory chain. Mitochondrial dynamics was studied by transmission electron microscopy (TEM). Fibroblasts from individuals affected by DARS2 deficiency were established from skin biopsies of two affected siblings (Patient 1: 8 years and Patient 2: 4 years) and an asymptomatic sibling, who is not a carrier (Control). Mice receiving reserpine showed inhibition of complex I activity in the striatum, as well as changes in mitochondrial dynamics characterized by an increase in the size and branching of mitochondria in skeletal muscle. These changes were associated with reduced levels of BH4 in the brain, serum, and urine. DARS2-deficient fibroblasts exhibited reduced activities of complexes I and IV of the respiratory chain. Transcriptome analysis revealed the negative regulation of genes involved in the production of BH4 and several mitochondrial proteins related to energy production, including the subunits of complexes I, III, IV and V. Additionally, the positive regulation of genes linked to the activation of response to hypoxia was also identified. This impairment in BH4 metabolism was confirmed by evaluating the expression of GCH1, a key gene involved in the production of BH4. Furthermore, GTPCH activity (encoded by GCH1) was not modified when stimulated with the canonical activator, lipopolysaccharide (LPS; 24 h; 2 mg/mL). The reduction in the capacity to synthesize BH4 was not justified by the presence of single nucleotide polymorphisms in the GCH1 gene, which had previously been reported to be associated with reduced BH4 synthesis. The information presented in this work shows a new and intimate association between mitochondrial physiology and dynamics with the BH4 metabolism in tissues with high energy demand. Altogether, it can be postulated that the administration of BH4 could result in a new approach to the treatment of mitochondrial disorders, especially those of genetic origin for which there is no cure or effective treatment.