Efeitos da indução de estresse de retículo endoplasmático sobre o desenvolvimento in vitro de embriões bovinos

Abstract

As biotecnologias aplicadas à reprodução animal encontram-se em plena expansão comercial; o Brasil possui o maior rebanho comercial bovino do mundo, e utiliza em larga escala a produção in vitro de embriões (PIVE). Apesar de bem estabelecida, esta biotecnologia apresenta desafios para aumentar a sua eficiência, minimizando fatores que tornam o ambiente in vitro subótimo. O objetivo deste trabalho foi determinar as consequências do estresse de Retículo Endoplasmático (RE) em diferentes fases do desenvolvimento embrionário in vitro na espécie bovina. Realizou-se inicialmente um experimento dose-resposta (25, 50 e 100 µM) de um agente inibidor de estresse de RE, Ácido Taurousrodesoxicólico/TUDCA (TD). Em um segundo experimento dose-resposta (0,1, 1 e 10 ng/ml) foi avaliado o efeito de um indutor de estresse de RE, Tunicamicina (TN) durante todo o período de cultivo embrionário in vitro (CIV). Posteriormente, com a finalidade de determinar em que momento do desenvolvimento embrionário o estresse de RE é mais deletério, os embriões receberam o tratamento na dose de 1 ng/ml de TN em diferentes momentos do CIV, correspondentes ao período anterior (D 1-3), durante (D 3-5) e pós (D 5-7) ativação do genoma embrionário (EGA). Em um quarto experimento, com a finalidade de comprovar que a indução de estresse gerada pela TN tem ação no RE, realizou-se a associação de TN+TD em diferentes momentos do CIV, seja durante todo o período do desenvolvimento embrionário (TN+TD 1-7), e durante a AGE (TN+TD 3-5), comparados a grupos tratados somente com TN de maneira isolada nos mesmos períodos. Os principais resultados obtidos demonstram que o uso de TD na dose de 100µM foi capaz de melhorar a qualidade dos embriões produzidos comparados ao grupo controle. Ao contrário, observou-se que TN prejudicou o desenvolvimento e qualidade dos embriões de maneira dose dependente. Além disso o efeito negativo da TN foi mais evidente durante e após a AGE. A associação do TD foi capaz de atenuar os efeitos deletérios da TN sobre o desenvolvimento. Foram ainda avaliados genes relacionados ao RE (GRP78, ATF6, PERK, IRE1, XBP1-s, XBP1-u) e fatores de pluripotência (OCT4, SOX2, NANOG) em embriões tratados com TN de maneira isolada ou em associação com o TD em diferentes momentos do CIV, mas, não foram observadas diferenças significativas nos níveis de expressão dos genes avaliados no estádio de Blastocisto. Em conjunto os dados obtidos permitem afirmar que o estresse de RE é um importante aspecto relacionado à viabilidade embrionária, além disso a atenuação proporcionada pela adição de TD de maneira isolada tem efeito benéfico sobre a qualidade dos embriões produzidos.

Abstract: Animal reproductive biotechnologies are extensively used for commercial applications worldwide. In this context, Brazil is the country with the largest commercial cattle herd in the world, and extensively take advantage of biotechnologies such as In vitro embryo production (IVP). This biotechnology still has gaps that should be overcome towards improvement of its efficiency, minimizing factors that render the in vitro environment suboptimal. The aim of this study was to determine the detrimental consequences of Endoplasmic Reticulum (ER) stress at different stages of in vitro embryonic development in cattle. Initially, a dose-response experiment (25, 50, and 100 µM) of tauroursodeoxycholic acid/TUDCA (TD), an ER stress inhibitor agent, was conducted. In a second dose-response experiment (0.1, 1, and 10 ng/ml), the effect of Tunicamycin (TN), an ER stress inducer, was evaluated throughout the in vitro embryo culture period (IVC). Subsequently, to determine at which stage of embryonic development ER stress is most deleterious, embryos were treated with 1 ng/ml TN at different time points of IVC, corresponding to pre- (D 1-3), during (D 3-5), and post- (D 5-7) Embryonic Genome Activation (EGA). In a fourth experiment, to confirm that TN-induced stress acts on the ER, TN+TD association was performed at different time points of IVC, either throughout the embryonic development period (TN+TD 1-7), or during embryonic genome activation (TN+TD 3-5), compared to groups treated only with TN alone in the same periods. The main results demonstrate that the use of TD at a dose of 100µM was able to improve the quality of the embryos produced compared to the control group. Conversely, in embryos treated with TN, impairment of embryo development and quality was observed in a dose-response way. Furthermore, the negative effect of TN was more evident during and after EGA. Nevertheless, TD association was able to attenuate the deleterious effects of TN on embryo development. Genes related to ER (GRP78, ATF6, PERK, IRE1, XBP1-s, XBP1-u) and pluripotency factors (OCT4, SOX2, NANOG) were also evaluated in embryos treated with TN alone or in combination with TD at different time points; no significant differences in gene expression levels were observed at the blastocyst stage. Overall, the data obtained herein allow us to conclude that ER stress has an important role on embryonic viability, and the addition of TD alone has shown a beneficial effect on the quality of the embryos produced.