Expressão e purificação de uma protease glicilglicina de Pseudomonas aeruginosa com potencial biotecnológico

Abstract

A comunidade científica enfrenta desafios na supressão de patógenos do gênero Staphylococcus sp., devido à sua adaptabilidade e resistência aos antibióticos. Logo, torna-se imprescindível promover pesquisas que visem à confecção de novas estratégias para combater esses estafilococos. Determinadas espécies são capazes de produzir proteases, substâncias que atuam na degradação das glicoproteínas da parede celular do gênero Staphylococcus sp. por meio da quebra das pontes laterais glicilglicina que a constituem, como no caso da lisostafina. O projeto objetiva encontrar uma espécie que possua uma protease com a função supracitada, para expressar, purificar e testar seu potencial de degradação. Primeiramente, realizou-se uma triagem in silico por espécies do gênero com potencial produção desta enzima. Averiguou-se a capacidade da espécie S. aureus ATCC 25923 para a produção de lisostafina (Lys), todavia sem sucesso. Em contrapartida, uma cepa ATCC 27853 de P. aeruginosa tinha em seu genoma um gene codificante para um homólogo da enzima, denominado lasA. Seu DNA genômico foi extraído e utilizado na amplificação por reação em cadeia de polimerase (PCR). Por conseguinte, para a construção do recombinante pET28a-Lys, foi realizada a digestão do gene da lisostafina e do vetor molecular pET28a. Inseriu-se o fragmento no vetor através da digestão com enzimas de restrição, e então efetuou-se a ligação. Células receptoras E. coli DH5α foram preparadas para receber o plasmídeo por meio da eletrocompetência, a qual consiste no uso de um pulso elétrico para alterar a membrana, tornando-a permeável à inserção do pET28a-Lys. Essas foram cultivadas e selecionadas através da adição de antibiótico no meio de crescimento. As colônias crescidas foram digeridas e analisadas por PCR e eletroforese em gel de agarose. As etapas de eletroforese foram repetidas diversas vezes, pois o equipamento apresentava má condução da corrente elétrica. Em suma, com os resultados obtidos, é possível inferir que o gene codificante para a protease foi amplificado satisfatoriamente. As células E. coli DH5α preparadas por eletrocompetência e transformadas com o recombinante foram cultivadas e apresentaram crescimento, evidenciando a funcionalidade deste método. Entretanto, na confirmação por eletroforese em gel de agarose, não foi possível obter a confirmação do recombinante para a subsequente realização do sequenciamento.